Análisis de Listeria monocytogenes

El monitoreo y análisis de Listeria monocytogenes es uno de los más demandantes entre los microorganismos patógenos.

Las características del lento desarrollo de este microorganismo, lo hacen particularmente especial para ser detectado mediante la microbiología tradicional.

Los pasos a seguir son virtualmente idénticos al del resto de los microorganismos patógenos:

1) Pre-enriquecimiento (para pre-seleccionar y acondicionar al microorganismo para el siguiente c/paso)
2) Enriquecimiento selectivo (donde se busca generar de pasar de 1ufc/g hasta 1,000,000 ufc/g o hacerlo crecer 6 logaritmos; para que pueda ser detectado por el método tradicional posterior ó alguna de las técnicas rápidas existentes en el mercado como el PCR, la tecnología ELISA o sus variantes, la inmunoprecipitación visual en látex o con oro coloidal y similares).
3) Enriquecimiento diferencial (los pasos previos suelen ser regularmente en caldos por el mejor desarrollo en medio líquido que el agar; en este paso se busca aislar el microorganismo para generar colonias puras que luego puedan ser detectadas mediante pruebas bioquímicas presuntivas, confirmatorias o serológicas posteriormente).
4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas (Se corre una serie de pruebas para buscar diferenciar las colonias puras que se hayan seleccionado por características morfológicas como forma, color, brillo y/o similares acorde a la literatura reportada)
5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas (Con los resultados de las pruebas presuntivas, se tiene suficiente evidencia para seleccionar una batería de análisis bioquímicos altamente específicos que son exclusivos del microorganismo objetivo).
6) Pruebas Serológicas (Se busca la confirmación detallada de género y especie del microorganismo con pruebas de de antígeno-anticuerpo o serológicas que básicamente permiten la confirmación de la identidad del germen sin dejar lugar a dudas).

En el caso específico de Listeria monocytogenes y dado que la prueba es extremadamente larga y con múltiples pasos detallados, se presenta un resumen de los pasos a seguir (anexamos dos vínculos de hipertexto detallados para su posterior consulta; el manual BAM de Estados Unidos y la Norma Oficial Mexicana 143 :
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/143ssa15.html
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm071400.htm

La técnica se usa con 25 ó 375 gramos de muestra de alimento ó 1mL de buffer residual de monitoreo con hisopo de dacrón o rayón usando un hisopo con Buffer neutralizante como el SRK de Copan, el caldo Letheen o similares) ó 10mL de buffer residual para monitoreo con esponja de celulosa estéril -el modelo más usado en el mundo son las bolsas Whirlpack de Nasco; vea la página de Nasco -www.enasco.com- para más detalles en cualquier parte del mundo o solicite informes en www.serco.com.mx si ud. desea adquirir alguna en México.

El primer paso es pre-enriquecer siguiendo la proporción 1:9 (25 en 225mL ó 1 en 9mL ó 375 en 3375 mL de medio de cultivo) durante un mínimo de 24-48 horas. Puede usarse caldo fraser modificado con cloruro de litio ó caldo UVM ó caldo Demi Fraser o Caldo de Enriquecimiento para Listeria con suplementos como PALCAM u otros) ó Caldo Soya Tripticaseína con 0.5% de extracto de levadura. Listeria monocytogenes es un microorganismo que crece en un rango muy amplio de temperaturas; universalmente se desarrolla mejor a una temperatura inferior al rango de enterobacterias: 30°C en vez de 35 a 37°C.

Posteriormente, el enriquecimiento selectivo se hace con Caldo de Enriquecimiento Bufferado para Listeria adicionado con Sales y Ácido MOPS ó según la técnica puede usarse el mismo Caldo Demi Fraser ó algún medio UVM modificado (por 24 a 48 hrs. adicionales a 30°C).

Al terminar el pre-enriquecimiento o la combinación del mismo con el enriquecimiento selectivo, suelen correrse los análisis rápidos de Screening que reconoce BAM. Para cualquier persona física o moral interesada en México en saber más al respecto, anexo un vínculo de una presentación comercial intitulada Listeria 2009.xls donde se describen métodos comercializados por Serco Comercial que tienen aprobación AOAC-OMA.
http://mail.serco.com.mx/apps/ierm/faqs.nsf/90c9ef7d3fabe69886256fff00019e34/bb83ca2ea41b4a768625725f007f1361/$FILE/LISTERIA%202009.xls

Se continúa con el enriquecimiento diferencial en placas. Los agares preferidos incluyen:
1) Agar MOX
2) Agar Oxford
3) Agar PALCAM
4) Agar LPM
5) Cromagar Listeria
6) ALOA (Agar Cromogénico Selectivo para Listeria)

Cada uno de ellos tiene un crecimiento específico para Listeria monocytogenes y para los demás microorganismos del género Listeria. En el caso de L.m. suelen ser negras con un halo negro o negruzco alrededor de las mismas en medios que contienen sales de esculina. Este paso conlleva 24 a 48 horas adicionales a 30°C.

Una vez que se tomaron las colonias representativas, la batería de pruebas bioquímicas presuntivas incluyen:
1) Prueba de movilidad (10min)
2) Prueba de Catalasa (10min)
3) Tinción de Gram (16-24 hrs)

Y las confirmatorias:
1) Beta hemólisis a 35°C por 48 hrs.
2) Movilidad en medio SIM por 7 días a temp. ambiente (25°C)
3) Reducción de nitratos a 35°C por 5 días
4) Prueba de CAMP a 35°C por 24-48 hrs.

Las pruebas finales para confirmación incluyen serología en Caldo Triptosa por 24- 48 horas adicionales (incubación a 30°C) para determinar si corresponde a los serotipos 1, 4 u otros.

Aunque se ha descrito de manera muy general el análisis y monitoreo de Listeria monocytogenes, al nivel de uso en plantas procesadoras de alimentos que conlleven un riesgo en el producto, desde el punto de vista técnico y económico, usar una prueba rápida para hacer un "screening" o detección previa de la existencia del germen, se ha convertido en la práctica más comúnde las empresas a nivel mundial. Esta bacteria es tan peligrosa, que debe acentuarse su detección a nivel de pre-operacional y operacional, especialmente en superficies de contacto, directo o indirecto más lugares húmedos y medio ambiente (sistema de aire y ventilación).