Tecnología de PCR para detección de patógenos

Después de una pequeña pausa, empezaremos a comentar con una frecuencia al menos semanal, de los tópicos que nos llevaron a crear este blog.

El tema de hoy es La Tecnología de PCR para detección de patógenos.

Desde los primeros tiempos en que empezaba la microbiología como la conocemos hoy, hacia finales del siglo XIX, con las investigaciones del Dr. Pasteur, el Dr. Koch, Samuel Petri, el Dr. Salmon y muchos renombrados individuos que pueden ser considerados como los iniciadores y que dejaron su huella para la posteridad, el ser humano se ha visto en la creciente necesidad de buscar encontrar, detectar y monitorear los seres biológicos invisibles que hoy en día conocemos a nivel genérico como microorganismos o microbios.

Este fascinante mundo, que en términos reales fueron los que primeros seres vivos que existieron sobre la Tierra (por ser la mayoría de ellos seres vivos unicelulares ó conformados por una sola célular) sigue siendo tema de estudio permanente desde esos tiempos y afortunadamente para la raza humana, se han seguido mejorando notablemente las diferentes metodologías de análisis para poder dictaminar su existencia hasta género y especie.

Hablando en términos específicos para monitoreo de microorganismos patógenos, como los que hemos hablado en temas anteriores, específicamente para tres de los microorganismos que más enfermedades causan en el ser humano y que son transmitidos mayoritariamente por consumo o ingesta de alimentos contaminados, a saber: Salmonella, Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7 (EHEC) existen tres grandes grupos de pruebas para detectarlos:

1) Microbiología tradicional en agares, caldos y serología.

2) Detección inmunológica rápida por anticuerpos en varios formatos:
Formatos de ELISA
Formatos de Inmunoprecipitación en Látex
Formatos de Inmunodifusión
Formatos de Inmunocaptura Magnética

3) Detección mediante Análisis del Material Genético de los microbios usando la tecnología de PCR (Polimerase Chain Reaction) ó de Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés.

En esta entrega del blog, comentaremos con cierto detalle qué es el PCR.

En términos muy entendibles, recordemos que todos los seres vivos y los virus (que no se consideran a nivel biológico como seres "vivos" en toda la extensión de la palabra, pero que son entes biológicos o seres que tienen características especiales) están constituidos de varios sistemas que mantienen las células que los conforman. En todos los casos, la estructura biológica por excelencia encargada de darle la "forma" a cada ser vivo, es el Acido Desoxirribonucleico o ADN (DNA en inglés). Este componente, se encuentra en los cromosomas de cada ser vivo y en el núcleo de cada microorganismo.

El ADN, es 100% único para cada ser vivo. Al ser formado por una cadena de 4 moléculas llamadas nucleótidos con sus respectivos pares complementarios y que forma una cadena o doble hélice con tramos tan cortos como 100 pares hasta varios millones, como en algunos genes humanos, existen trillones de combinaciones en esa cadena. Por la misma razón, pueden existir trillones de individuos con características totalmente distintas entre sí.

La tecnología de PCR ha tomado ventaja de esa peculiaridad del ADN y por medio del aislamiento de una parte o sección de la cadena de doble hélice, mediante un dispositivo biológico llamado Sonda y con la ayuda de una enzima especial conocida como TAQ POLIMERASA, cuya función es crear un número indeterminado de copias de fragmentos del ADN creando polímeros o copias idénticas de los los mismos, ha revolucionado por completo el mundo diagnóstico creando de facto, la disciplina que hoy llamamos Biología Molecular.

Los elementos que requiere esta tecnología son:
1) Primers
2) Sonda
3) Target u Objetivo
4) Taq Polimerasa
5) Termociclador de punto final ó de Tiempo Real
6) Sistema para detectar las copias al final (Electroforesis en gel, curvas de fusión por fluorescencia, curvas de producción de copias marcadas con fluorescencia (PCR Tiempo Real)
7) Control interno

Cada uno de los elementos cumple con una función específica:
1) Los primers es la secuencia específica de nucleótidos del ADN que son específicos del organismo que estamos tratando de detectar.

2) La sonda, que en el caso de los sistemas de Tiempo real suele ir marcada en los extremos, con un elemento conocido como Quencher (o amortiguador) y con otro que es un agente Fluorogénico o Fluoróforo. Se puede describir como una sección complementaria para los primers del microorganismo que estamos buscando detectar.

3) El target u objetivo es la secuencia simple complementaria a la que la sonda se unirá para generar su duplicación "n" veces en el ciclo que llamamos amplificación.

4) La Taq Polimerasa, es una enzima aislada del microorganismo Thermus aquaticus, encontrado en las fuentes termales de Yellowstone, Estados Unidos. Esta enzima es la responsable de generar copias o formar "polímeros" del target u objetivo, si tiene las condiciones necesarias de temperatura, acidez y oligoelementos como el cloruro de magnesio en una solución acuosa.

5) El termociclador es un dispositivo diseñado para generar de manera alterna condiciones de temperatura en rangos de 55 hasta 95°C, que permiten que la Taq Polimerasa pueda cumplir con su función de generado de copias o "amplificar" el ADN. Existen dos tipos básicos: Los de gradiente de temperatura en bloque sólido (aquí entran los de compañías como Applied Bioresearch, los de Qualicon, BioRad y otros más) y los rotativos (como el RotorGiene de Corbett Research, ahora de QIAGEN y los LightCyclers de Roche). Normalmente corren 40-50 ciclos en períodos desde 60 segundos hasta poco menos de 5 minutos; por lo cual el proceso de termociclado demora desde 45 mins hasta 3-4 horas.

6) El sistema más usado para detectar las copias generadas hasta hace poco menos de 20 años eran los sistemas de electroforesis en gel; en los últimos 10 años, surgió con más fuerza el uso de fluoróforos como el SYBR-GREEN, para poder medir la curva de fusión de los ciclos de amplificación y en los últimos 5 años, ha tomado más fuerza el uso de equipos termocicladores Tiempo Real, que usan fluoróforos altamente específicos y selectivos, que permiten incluso cuantificar concentraciones en función de las curvas de generación de la fluorescencia (en todos los casos anteriores, el termociclador tiene acoplado el sistema para detectar el SYBR-Green u otros fluoróforos; sólo para la electroforesis en gel se hace en equipos por separado).

7) El uso de controles internos se ha extendido cada vez más para demostrar, comprobar, verificar y validar al mismo tiempo que realmente ocurrió la reacción de amplificación. Estos suelen añadirse en los tubos de reacción o en los capilares que se introducen en el termociclador.

Para terminar esta descripción general sobre la Tecnología de PCR, cabe señalar que son cada vez más las empresas de todo tipo a nivel mundial y especialmente aquellas que elaboran productos sensibles a nivel microbiológico como las de alimentos congelados para consumo inmediato (RTE por las siglas en inglés), de alimentos para niños y/o fórmulas nutricionales, empresas de cárnicos procesados, empresas de productos lácteos frescos y procesadoras de alimentos orgánicos, las que han adoptado el uso comercial de esta tecnología.

Si usted está realmente interesado en alguna, busque que incluya preferentemente algun sistema de concentración de la muestra mediante un proceso como la Inmunoseparación Magnética (IMS en inglés), que es la tendencia de esta tecnología. Usar IMS acoplada con PCR Tiempo Real para buscar resultados en mucho menor tiempo de lo que tarda el método tradicional o pruebas inmunológicas como las que mencionamos anteriormente.

Actualización al Mes de Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs