Aprovechando las oportunidades que brindan a la industrias las pruebas rápidas para patógenos

Estamos terminando el año 2020.

De manera personal y tras estar involucrado la mitad (literalmente) de mis años de vida en el mercado de la Seguridad e Inocuidad Alimentaria (desde 1996 a la fecha en que se escriben estas líneas)  me sigue resultando extraño que la penetración que tienen las pruebas rápidas para patógenos en la industria de alimentos de nuestro país (México) siga estando tan limitada y restringida.

Las normas oficiales mexicanas para patógenos tuvieron una actualización masiva hace ya casi 6 años con la publicación de la NOM-210, que homologa los procesos de monitoreo de los 3 microorganismos patógenos más buscados en alimentos con las normas ISO (Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus) y algunas adicionales para E.coli genérica (seguimos sin norma oficial para detección o monitoreo de E.coliO157:H7 ó las bacterias STEC).

Basado en las observaciones que nos dicta el estudio y abastecimiento de manera profesional de ensayos rápidos para estos microorganismos, podría calcular que menos del 30% de las empresas mexicanas grandes las han implementado ya de manera directa y entre las decenas de miles de pymes y mipymes, el porcentaje no debe llegar ni al 10%.

Recapitulemos las ventajas para un productor de una prueba rápida para patógenos que sea de un fabricante confiable y que haya sometido ante una instancia internacional como ISO, AFNOR, MicroVAL o AOAC su producto y que además, haya resultado con excelentes calificaciones de desempeño en cuanto a reproducibilidad, sensibilidad y especificidad:

1) Obtiene resultados 50 a 75 % más rápido = Liberar lotes 50 a 75% más rápido

2) Encuentra problemas potenciales de contaminación como Listeria en menos de 2-3 días vs. casi 1 a 2 semanas del método tradicional para reducir potencialmente pérdidas millonarias.

3) Certifica y valida que el sistema de Gestión de la Inocuidad o Seguridad Alimentaria en el sitio, realmente está trabajando y bajo control.

4) Reducción de pérdidas por productos contaminados en el mercado.

5) Protección de la marca y de la empresa detectando prematuramente fallas en el sistema de calidad.

6) Reducción de costos de laboratorio por envío a tercerías en los casos donde la empresa monta sus propios laboratorios analíticos.

Puedo seguir mencionando más ventajas, pero mi objetivo con esta entrada es simplemente reflexionar por qué - si en su empresa pueden hacerlo- todavía no ha empezado a beneficiar a su compañía y a sus accionistas.

Hay varias empresas con renombre internacional que manejan pruebas rápidas altamente confiables, incluyendo a Merck-MilliporeSigma, Neogen Internacional; Promicol, 3M y R-Biopharm por citar algunas de las más conocidas y reconocidas que usted puede encontrar en México.  

Como Director Comercial de una empresa que las distribuye, le garantizo que si decide un proceso de implementación con metodologías que su proveedor le pueda demostrar y comprobar que serán de utilidad.  Exíjale apoyo al proveedor que seleccione.  No se vá a arrepentir.

Para terminar, las más comunes que puede buscar-encontrar son:

1) Pruebas de flujo lateral (como las de embarazo)

2) Pruebas por PCR de tiempo real Con / Sin IMS incluida-acoplada

3) Pruebas de PCR de punto final

4) Pruebas de ELISA

5) Pruebas basadas en Agares Cromogénicos

6) Pruebas basadas en ATP-Impedancia-Colorimetría-Otros

Las dificultades que ha traído el Covid-2019 a la Industria Alimentaria

 El año que estamos a poco menos de 6 semanas para terminar ha sido particularmente atípico para todos los seres humanos que habitamos nuestro planeta por la Pandemia causada por el Virus de la familia de los Coronavirus SARS-CoV2, comúnmente conocido como Covid19.

Aunque los primeros casos empezaron aproximadamente hace un año, en Wuhan China, provincia de Hebei por allá de Noviembre de 2019, poco a poco fue creciendo y diseminándose al grado que tan sólo un año después, ha causado casi 1,500,000 de muertes a nivel global, se está acercando a la barrera de 60,000,000 de infectados y está ahora presente en más de 120 países del globo, incluyendo por supuesto a México.

¿Qué retos particulares le ha traído el Covid19 a la industria alimentaria?

Múltiples y variados, entre otros:

1) Pérdida de ventas masivas en algunos giros por las severas restricciones a la movilidad impuestas en diferentes lugares desde Enero hasta la fecha para buscar evitar la diseminación del virus.

2) Cierre de negocios de manera definitiva en muchas partes del mundo de restaurantes y servicios de alimentos por la imposibilidad física y operativa de convertir al sistema en todo para llevar.

3) Debido a los contagios en plantas de alimentos del personal y la necesidad de aislamiento preventivo por al menos 14 días en los casos no graves, en muchas empresas han tenido que reducir, cerrar, disminuir o cancelar turnos de producción; dificultad para reemplazar personal especializado; retiro de personal vulnerable de las plantas por co-morbilidades como obesidad, diabetes, hipertensión y otras enfermedades crónico-degenerativas que atacan a todas las clases sociales, edades, razas y sexos.

Se espera que al cierre del año en curso, empiecen los primeros procesos de inmunización ante una pandemia que ha transtornado la vida y hábitos de todos los seres humanos.

¿Cuánto tiempo más continuará la problemática causada por este virus?

De acuerdo a especialistas médicos y epidemiólogos, el proceso completo una vez que empiecen los primeros esfuerzos de inmunización mediante vacunas desarrolladas  de un proceso que demora 2-3 años a menos de 6 meses, posiblemente involucre un marco de tiempo de 9 a 24 meses adicionales a partir de Diciembre del año 2020.  Esto quiere decir, que todavía hay un largo camino por recorrer para volver a lo que alguna vez consideramos "normalidad".

Por ahora y después de un largo período sin alimentar este blog, hacemos una pausa.

¿Qué implicaciones tiene la Seguridad Alimentaria bajo FSMA?

Durante más de 2 décadas, hemos estado personalmente involucrados en divulgar a lo largo y ancho de la República Mexicana de tòpicos de Seguridad Alimentaria, buenas prácticas de manufactura (BPM ó GMP por las siglas en inglés); procedimientos de operación estàndar de saneamiento (POES ó SSOP por las siglas en inglés), el programa de Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control (HACCP) que evolucionó al ahora HARPC (Análisis de Riesgos y Controles Preventivos) bajo la FSMA que su vez el presidente de EUA, Barack Obama firmó en 2011 y sigue siendo un hecho bastante singular que en pleno siglo XXI (Diciembre de 2019 en el que estas lìneas se escriben) y que actualmente casi cualquier información està al alcance del toque de una pantalla táctil en un celular ó Tablet ó al click de un cursor en una computadora de escritorio ó portátil, la industria alimentaria, cosmética y farmaceútica siga teniendo que lidiar con aspectos básicos que ponen en riesgo toneladas de productos diariamente por actividades tan sencillas como lavarse las manos inadecuadamente, no separar correctamente utensilios con productos alergènicos de otros ò tener especial precauciòn con evitar charcos o acumulaciones de humedad donde pueden crecer microorganismos tan peligrosos como Listeria monocytogenes.

Revisando por otras cosas, encontramos un artìculo que llama más que la atención por las consecuencias de orden judicial-penal que puede tener una falla en seguridad alimentaria y que ocasione daños a terceros con enfermedades catastróficas o inclusive la muerte.

Me permito compartir una imagen de un curso de BPM básico para operadores que nos tocó impartir casi una centena de ocasiones entre 1996 y 2005:

Cuando estaba en esa parte de la exposición hace 20 años atrás, comentaba sobre el riesgo de poder ir a la cárcel por demandas de consumidores que hubieran sido afectados y que hicieran un juicio contra quien resultare responsable.

Escribiendo esto en Diciembre de 2019, me permito citar un artículo de la revista Food Quality and Safety (/from Farm to Fork) que puede consultarse en:

https://www.foodqualityandsafety.com/article/pca-prison-terms-put-industry-on-notice-about-responsibility/

y la imagen del mismo y el título:

PCA Prison Terms Put Industry on Notice About Accountability

en español:

Los términos de prisión de PCA ponen a la industria en aviso sobre la responsabilidad

escrita por Kathy Holliman y publicado el 2 de Octubre de 2015.

En resumen, por una notable serie de eventos con fuerte negligencia, que los jueces equipararon a conducta criminal, resultaron en sentencias de càrcel para los altos directivos por 28 y 20 años, 5 años para la Gte. de Control de Calidad y sentencias de 3 y 6 años para ejecutivos medios de la empresa ahora extinta Peanuts Corporation of America o PCA.

Esto se llevó a cabo bajo la ley FSMA y sus consecuencias legales.

Volviendo al título de esta entrada en el blog:

¿Qué implicaciones tiene la Seguridad Alimentaria bajo FSMA?

R = Muchas, de todo tipo y ahora màs que nunca, de tipo legal con fincado de responsabilidades penales donde la seguridad alimentaria no se considere como la máxima prioridad para los altos directivos de las compañías que fabriquen, produzcan, cultiven o procesen alimentos frescos o de cualquier otro tipo y que causen daños a la salud de los consumidores.

Es una realidad que los actuales directivos de las compañìas de 2a. o 3a. generación, estàn siendo lideradas por jòvenes que en esta época son conocidos como Millenials (nacidos entre 1985 y 1995 con edades entre 24 y 34 años de edad) son màs que conscientes de las leyes actuales sobre seguridad en alimentos y la enorme responsabilidad que involucra la inocuidad alimentaria; sin embargo, el tema no está agotado y tiene mucha tela de dónde cortar para interiorizar con màs detalle de por què es importante que las compañías productoras hagan LO NECESARIO para producir alimentos seguros, independientemente que sean para mercado de exportaciòn o no.

La salud de los consumidores mexicanos y del mundo entero no es negociable.

Ahondaremos màs en el futuro.

Breve Historia de los Equipos de Biolumiscencia de ATP Parte 2, 5 años después (1a. Parte)

Breve Historia de los Equipos de Biolumiscencia de ATP Segunda Parte (Actualización y Detalle de Características de cada equipo 5 años después)

[1a. Parte]

Hace poco menos de 5 años, publicamos una entrada en este blog intitulada: "Breve Historia de los Equipos de Bioluminiscencia de ATP y aspectos a ponderar en cada uno de los sistemas", misma que puede ser consultada en el siguiente enlace:

http://iso22000yhaccp.blogspot.com/2014/11/Historia-Breve-Equipos-de-ATP.html

Ahora, terminando el mes de Febrero de 2019 y haciendo un análisis retrospectivo de lo que ha ocurrido en este tiempo con los avances en la tecnología de cada uno de los fabricantes, podemos comentar lo siguiente:

1) En el mercado mexicano se pueden encontrar alrededor de 8 marcas comerciales distintas y a nivel mundial, son algunas adicionales ó marcas OEM maquiladas por 1 o 2 de los fabricantes de los equipos de precio más accesible.

2) Debido a que mis colaboraciones en este blog no pretenden incluir información abiertamente en contra o favor de ningún equipo (debido a que el suscrito funge como Director Comercial de una de las empresas que más tiempo tiene de vender esta tecnología) me permito describir los avances y características de cada uno de los equipos mencionados (sin decir su marca, el lector podrá buscarla en internet ó en el blog comercial del que esto escribe en serco-microbiologia.blogspotc.com):

a) El equipo de una de las compañías trasnacionales más grandes del mundo y con presencia en más de 150 países fue actualizado en el año 2016 (primera versión en 1995, segunda en 2004).  Es una versión con un software más poderoso para análisis de datos. No incorpora aún pantalla táctil, pero tiene display a colores. Sigue con baterías recargables de Li-MH de alta duración. Le incorporaron transferencia de datos inalámbrica (Wireless) y el software incorporado junto con el equipo incluye estadística para re-muestreos y algunos datos interesantes adicionales. El diseño es ergonómico para usarse con una mano.  Sigue usando exactamente los mismos hisopos para superficies y líquidos vigentes desde 1998. No cuenta con calibradores trazables externos.  Tiene controles positivos para verificar la calibración. Sigue funcionando exclusivamente como equipo monoparamétrico (ATP en superficies y líquidos) para validación de limpieza en tiempo real. Usa escala de URL que el usuario debe validar-configurar para su proceso siguiendo las guías recomendadas por el fabricante.  Sigue incorporando PMT (Tubo Fotomultiplicador de Fotones), tiene sensor de temperatura.

b) El equipo de otra de las compañías que lanzaron su primera versión al mercado entre 1995 y 1996, luego en el período entre 2000 y 2005 desarrollaron hasta 3 equipos diferentes y finalmente se quedaron con una sola versión, fue actualizado también entre 2015 y 2016. Principales mejoras:  Gráficas en pantalla, uso de pantalla táctil, a colores, software analítico mejorado. Tamaño más reducido que cabe en la palma de la mano. Sigue usando baterías recargables Li-MH.  Transferencia de datos a la computadora por cable y por Wi-Fi. Incorpora planes de muestreo, re-muestreo, re-ordenamiento aleatorio de planes y otros más.  Puede leer otros hisopos diferentes al ATP.  Sigue usando los mismos hisopos para superficies y líquidos vigentes desde 1998.  No cuenta con calibradores trazables externos. Tiene controles positivos para verificar la calibración. Usa escala de URL donde el usuario debe ajustar a cero sus áreas limpias. Sigue incorporando PMT, tiene sensor de temperatura.

c) El equipo que presume ser el mejor del mercado y que publica comparativos detallados en línea vs. todos los demás, pero que ofrece ahorrar de 40 a 50% en consumibles porque sus dispositivos de hisopo son más baratos en esa proporción que otros con un valor de mercado mucho más elevado finalmente incorporó en una versión lanzada al mercado en 2019 lo siguiente:  Ya no usa baterías alcalinas Doble A desechables o recargables.  Le incluyeron baterías recargables de Li-MH.  Tiene un nuevo formato de teléfono inteligente Sistema Android con pantalla a colores. Incluye gráficas en pantalla, planes de muestreo, re-muestreo, re-ordenamiento aleatorio de planes y otros más.  Transmite datos a la computadora por WiFi y en un futuro próximo, por el cable de mini-USB por el mismo puerto para carga de las baterías.  Promete leer todos los demás hisopos del fabricante, incluyendo los que tiene para microbiología de indicadores, fosfatasa alcalina, enzimas de cocción-pasteurización y para alérgenos.  Sigue usando los mismos hisopos originales del equipo lanzado alrededor del año 2000, con una nueva versión 10 años más tarde y esta versión táctil, actualizada con este lanzamiento en 2019. Usa escala de URL que el usuario debe validar-configurar para su proceso siguiendo las guías recomendadas por el fabricante.  En lugar de PMT, utiliza fotodiodo de avalancha (sensor de luz hasta 10 veces más económico que un PMT).

Un interesante artículo sobre Control de Alérgenos bajo FSMA en 2019

En la edición más reciente de Food Quality Magazine, se acaba de publicar un artículo sobre Control y Monitoreo de Alérgenos en plantas y empresas relacionadas con Alimentos, que caen bajo la regulación de la Ley de Seguridad Alimentaria (FSMA).

Este artículo se puede consultar en su idioma original en el siguiente vínculo:

https://www.foodqualityandsafety.com/wp-content/uploads/2019/02/FQU0119_FlipThrough.pdf

Páginas 18, 19 y 42.

Publicado por 2 de los especialistas más importantes para Control de Alérgenos, por ser Directores del FARRP (Food Allergy Research and Resource Program) de la Universidad de Nebraska en los Estados Unidos, nos dá un panorama muy completo de los puntos a considerar para un correcto control de alérgenos.

Dada su importancia, me permito enumerar los puntos más interesantes de dicha colaboración de los Dres. Taylor y Baumert:

1) Aunque la Administración para Drogas y Alimentos (FDA por las siglas en inglés) no ha ordenado o hecho mandatorio el uso de pruebas de control de alérgenos comerciales de manera oficial, se puede considerar que dichas pruebas permiten a las empresas tamizar y detectar los riesgos que conlleva la presencia de alérgenos no declarados en la etiqueta.

2) Debido a que uno de los elementos más críticos para la FSMA, es la implementación de CONTROLES PREVENTIVOS DEL RIESGO y que los alérgenos son considerados como un riesgo potencial para la salud de los consumidores a los que esta ley busca proteger, la limpieza del equipo compartido en un paso crítico para el control preventivo de alérgenos.

3) Todas las compañías de alimentos que usen algún ingrediente alergénico de los catalogados como de mayor riesgo a la salud (leche, huevos, pescado, mariscos, crustáceos, cacahuate, soya, nueces y frutos secos relacionados y el trigo por el gluten) deben desarrollar un Plan de Control de Alérgenos y procedimientos efectivos y consistentes para la limpieza de equipos compartidos.

4) Los hisopos de Alérgenos Específico pueden ser efectivos para evaluar la limpieza de superficies del equipo. Existen varias marcas comerciales en Estados Unidos que pueden conseguirse también en la República Mexicana.  Puede revisar el blog https://serco-microbiologia.blogspot.com ó el sitio http://www.romerlabs.com que presenta algunas de las opciones existentes. En el artículo menciona fabricantes adicionales como Neogen, Elution Technologies y R-Biopharm como opciones a considerar.

5) No se recomienda el uso de kits de flujo lateral para evaluar directamente materias primas o producto terminado por el riesgo de falsos negativos causados por el efecto gancho o de arrastre, que se genera cuando hay más de 1% de proteínas en la superficie o en la materia prima/producto terminado muestreado.  Es mejor utilizar un kit de Formato ELISA de alguna de las compañías enumeradas en el inciso anterior.

6) Los hisopos de proteína general existentes como las marcas de Charm, 3M y Millipore-Sigma, también son una alternativa real como parte de dicho programa de control de alérgenos, con la aclaración de que son para un tamizaje total de proteínas incluyendo las no alergénicas y que es recomendable su combinación con los ensayos señalados en el inciso 4.

7) Debido a su alta especificidad, en la opinión de ambos autores, es más recomendable el uso de Hisopos de Alérgeno Específico para la validación de la efectividad de los Procedimientos de Operación Estándar de Saneamiento (SSOP en inglés; POES en español).

8) Recomendaciones especiales para la selección de un sistema de monitoreo de alérgenos:

8.1    Escoja el hisopo apropiado.  El material de la punta debe ser más efectivo que los de punta de algodón y debe estar libre de proteínas (dacrón, rayón, poliuretano son los materiales más comunes usados por los fabricantes de los kits comerciales).   No se recomienda usar esponjas de celulosa porque tienden a retener proteínas y no liberarlas dificultando su correcta detección.

8.2   Seleccione el método de muestreo más apropiado.  Debe ser capaz de detectar los residuos de alérgenos en la matriz donde los vaya a buscar. Cada kit comercial es diferente.  NO ASUMA que un determinado kit detectará igual que los demás ni todas las formas en las que un alérgeno general como la leche puede presentarse en la matriz analizada (superficie ó alimento). Las condiciones de proceso afectan también a las proteínas alergénicas, especialmente los procesos térmicos. El exceso de proteínas en una superficie (más de 1% ó 10,000 ppm) suele generar falsos negativos por el efecto de enganche.  Pregunte y averigüe con su proveedor del kit comercial.

8.3  Fije una meta-objetivo de limpieza alcanzable.   Cada producto y proceso (Incluyendo aguas de enjuague de lavados por recirculación en sistemas cerrados ó Limpieza CIP por las siglas en inglés) deben ser evaluados de manera separada.   La meta final  para la validación de limpieza debería ser "negativo con hisopo de ensayo de Flujo Lateral (LFD) con "x" nivel de sensibilidad en partes por millón (ppm)" ó basta a veces con "No detectable con Ensayo de flujo lateral (LFD)".

8.4  Use la técnica apropiada.  Es imperativo que se monitoreen puntos de difícil acceso o que sean complicados para ser higienizados.  Se deben tomar múltiples muestreos al menos especialmente en las fases iniciales de la validación, para identificar los puntos o áreas más difíciles de limpiar. Estos puntos a su vez deben convertirse en el punto de enfoque para validaciones y verificaciones de limpieza subsecuentes en el futuro.  El protocolo de limpieza debe ser revalidado periódicamente o cada vez que haya cambios (formulación de producto, matriz del equipo muestreado, condiciones operativas de proceso, etc).

8.5  Interprete los resultados.  Los ensayos de LFD ofrecen resultados cualitativos, de manera que su interpretación general debe ser "Positivo" ó "Negativo" (se puede también considerar microgramos/cm2 ó por hisopo monitoreado acorde a la sensibilidad del kit de LFD).

8.5  Conozca cuándo debe revisarse o monitorearse el producto terminado.  Los resultados de un ensayo de LFD en superficies no se pueden traducir inmediata o exactamente en cierto nivel de contaminación del producto terminado.  Dependiendo del nivel de contaminación encontrado en la superficie con el LFD, puede ocurrir que el siguiente producto que pase por la superficie recolecte una cantidad aún menor que ocasione que no logre detectarse el alérgeno contaminante en dicho producto. El monitoreo de producto terminado es la única manera de asegurar que haya presencia de residuos contaminantes a un nivel detectable.

Muchas compañías procuran no hacer ese monitoreo de un alérgeno no declarado porque si lo encontraran, ocasionaría que ese producto automáticamente se descartara para ser vendido por la presencia de dicho alérgeno contaminante.

En resumen, mientras MÁS ROBUSTO sea su sistema de control de alérgenos en las superficies, menos probabilidades tendrá de que pueda llegar a tener una contaminación en los productos elaborados por su empresa.   La palabra clave es ROBUSTEZ DEL PROGRAMA.

                                 ----------------------------------------------------------

Espero que esta colaboración sea de utilidad para cualquier lector que esté buscando más información sobre cómo implementar un programa robusto de control de alérgenos.   Puede comunicarse con el suscrito al celular (052)811.999.0225 ó al 01.800.00.73726 Ext. 211 ó al correo-e: luis_quintanilla@hotmail.com donde con gusto le podremos asesorar con más detalles.

Diferencias entre un ensayo de PCR de Tiempo Real y un ensayo de Punto Final

Diferencias entre un Ensayo de PCR de tiempo real y uno de Punto Final

Con más frecuencia de lo común, la tecnología analítica de PCR y sus opciones para la expresión de los resultados, genera confusiones entre los usuarios y empresas o compañías interesadas en su implementación.

Los 3 tipos más comunes para la expresión de los resultados de un ensayo de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) son los siguientes:

* Electroforesis en gel

* Análisis de Curvas de Fusión en el PCR de Punto de Final

* Graficas de Fluorescencia de Tiempo Real en la técnica que le dá la misma denominación al PCR

Veamos brevemente cada una:

Electroforesis en gel:  

• Separa a los fragmentos de ADN por su tamaño
• Las muestras de ADN se cargan en ranuras en un extremo del gel y se les aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
• Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de éste pueden verse como bandas, que representan fracciones de ese ADN del mismo tamaño.

Ver la imagen adjunta

Análisis de Curvas de Fusión en el PCR de Punto Final:

• Incorpora con mucha frecuencia un marcador fluorescente conocido como SYBR GREEN que no es muy específico y puede unirse a fragmentos de ADN no buscados/deseados.
• No puede detectar ni cuantificar en tiempo real la secuencia blanco
• Se realiza al final de la reacción un paso extra realizando una curva extra ó curva de fusión (melting curve) que evalúa si se formó un producto único (característico del ADN buscado como el un patógeno como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7, etc) ó si hay presencia de dímeros de primers, que traducido en mundo real, son segmentos amplificados no deseados que conducirían a un resultado falso positivo ó que el algoritmo del software que analiza estos patrones no sepa intepretarlo ( y se produce algo llamado "Indeterminado").
• Esta curva demora entre 45 y 70 minutos en la mayoría de los termocicladores, es decir, le añade una hora al proceso analítico de interpretación de resultados.

Gráfica de una curva de fusión:

PCR en Tiempo Real:

• Dentro de la mezcla se incorpora una sonda  altamente específicas con un fluoróforo (hay al menos 6 tipos diferentes conocidos) que marca los fragmentos de ADN que está siendo amplificado. Esto ocurre en tiempo real de manera que si existe dicha amplificación será detectada con la formación de una curva característica que para dictaminar si es positivo, debe alcanzar un umbral o "threshold" mínimo
• Las sondas más comunes usadas tanto comercialmente como a nivel de investigación son las sondas TaqMan.

Entonces y en resumen para aclarar las diferencias, considerándolo como una persona que está buscando decidir entre un PCR de punto final y uno de Tiempo Real:

1) Los ensayos de Punto Final son más económicos que los de Tiempo Real.
2) Los ensayos de Punto Final son más tardados que los de Tiempo Real.
3) La especificidad del Tiempo Real es superior a del ensayo de Punto Final.
4) Existe una alta probabilidad de que en los ensayos de Punto Final existan resultados indeterminados tras el análisis de las curvas de fusión en comparación a los de Tiempo Real que suelen tener resultados directos positivos o negativos ó en su defecto, que la reacción no ocurriese y existan no amplificaciones.

Por el momento, hacemos una pausa y abordaremos otro tema en una próxima entrada.

Si desea saber más al respecto, comparto cuatro interesantes vínculos con datos bibliográficos en línea:

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis

http://www.unizar.es/lagenbio/docencia/doctorado/fundamentosPCR.pdf

http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf

Fundamentos del funcionamiento de un Ensayo de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Reacción en Cadena de la Polimerasa....¿Cómo funciona un Ensayo de PCR?

PCR por las siglas en inglés significa Reacción en Cadena de la Polimerasa. (Polymerase Chain Reaction).

Como su nombre lo indica, es una reacción de origen biológico, realizada por una enzima (sustancia de naturaleza proteica cada una diseñada para "n" número de funciones metabólicas) llamada Polimerasa.   Esta reacción bioquímica dicho de una manera muy coloquial, equivale a crear o más bien, recrear una copia idéntica de un fragmento de una cadena de  piezas del popular juego LEGO, con bloques complementarios marcados con diferentes colores.

Digamos que la base son cuatro colores: azul(AZ) rojo (/RJ), amarillo(AM) y verde(VR) (segnemto izquierdo) y sus complementos son bloques de colores blanco (BL), negro/(NG), gris (GR) y café (CF) (segnmento derecho)  Tendríamos una cadena de bloques de color AZ-BL; RJ-NG, AM-GR, VR-CF.

Supongamos ahora que tenemos la posibilidad de tener 10,000 bloques individuales combinando los pares anteriores en partes iguales complementarias cada una. Es decir 10,000 entre 8 = 1250 piezas de cada color.  Tendría 2500 bloques de AZ-BL, RJ-NG, AM-GR y VR-CF.  El orden de cada cadena es completamente aleatorio, por lo cual, puedo tener cientos de miles de millones de combinaciones de esta cadena formada por esos bloques.

Toda la descripción anterior, es una analogía del ADN ó Acido Desoxirribonucleico. Este elemento biológico es el maestro de la información genética celular y cada ser vivo sobre la Tierra tiene su propia cadena de ADN que indica qué función y hasta a qué especie pertenece cada ser vivo.

Tiene una estructura de doble hélice con pares complementarios (Adenina-Citosina-Guanina y Timina que se unen respectivamente entre sí como Adenina-Citosina y Guanina.-Timina ó AC, GT) mediante enlaces de hidrógeno).  Un conjunto de ciertas bases agrupado dentro del ADN es lo que forma un GEN ó una expresión biológica de qué controlará o generará dicho segmento de esa cadena, por ejemplo, si una bacteria tendrá una enzima que le permita metabolizar un azúcar ó una proteína o ser resistente a cierto antibiótico, etc.

Debido a la enorme complejidad técnica de lo anteriormente expuesto y que con este escrito estamos buscando que cualquier persona sin importar su grado escolar, pueda entender cómo funciona una reacción de PCR, sigamos comentando qué es lo que ocurre.

Lo que sucede en una reacción de PCR, es que tenemos a la polimerasa (la enzima constructora de los bloques); tenemos el target (o sección de los bloques seleccionados de cual queremos realizar una copia); tenemos el primer (o sección del fragmento de la cadena de ADN (lado izq. ó lado derecho) correspondiente al target buscado y en el caso de la tecnología conocida como PCR de Tiempo Real, tenemos a la sonda (molécula biológica que es una sección o bloque de ADN con 2 moléculas diferentes al inicio y al final, la más importante, la última que tiene una colorida de origen fluorescente).

Durante la reacción de PCR, digamos que queremos saber si en una muestra de un alimento, tengo presencia de la bacteria Salmonella.  Lo que ocurre, es que primero genero una multiplicación de la bacteria en esa muestra pre-enriqueciendo dicho alimento en medio especial. Cuando tenemos por lo menos 10,000 bacterias (1x10-4),  se extrae el ADN del núcleo de la bacteria para dejarlo expuesto calentando a cierta temperatura para dejarlo libre. Los reactivos del PCR es cuando entran en acción.  Se tienen target y primers como parte de la reacción que buscarán o seleccionarán el bloque correspondiente al ADN de la Salmonella. Una vez ubicados y mediante un mecanismo de calentamiento y enfriamiento, la enzima polimerasa empieza a generar copias del target con los primers presentes durante un ciclo de aproximadamente 2 a 4 horas, en fragmentos de 25 hasta 240 segundos, según la capacidad del instrumento o Termociclador que esté realizando los ciclos de temperatura para la duplicación.

En el caso del PCR de tiempo real, la sonda que está dentro del sistema de reactivos, se "pega" a o "adhiere ó une" a los segmentos del target que están siendo multiplicados.  Si se acumula un número suficiente de fragmentos multiplicados, se acumulará una concentración de fluorescencia colorida que puede ser medida por un dispositivo óptico dentro del Termociclador.   Si se formó un nivel de fluorescencia característica durante el período completo de la corrida, se genera una curva que se grafica en tiempo real y permite saber que si alcanza un umbral o nivel mínimo acumulable, quiere decir que el fragmento del ADN deseado en este caso de la Salmonella, sí está o no está presente y nos permite dictaminar si ese alimento presenta contaminación o no, por el germen buscado.

Recordemos que la Reacción en Cadena de la Polimerasa ó PCR, ha generado que se puedan realizar análisis de patógenos por PCR; también se les busca como prueba rápida de PCR ó ensayo rápido de PCR.  Su enfoque comercial más importante hoy por hoy, en análisis de alimentos, es para buscar microorganismos patógenos como Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7 y sus parientes STEC, Cronobacter sakazakii, virus, hongos, diferentes gérmenes nocivos, detección de especie animal y de contaminantes indeseados como clenbuterol, alérgenos, hormonas, etc.

Las siguientes tres gráficas ilustran el proceso de una manera mucho más visual:

Hay muchos detalles técnicos adicionales que se pueden discutir, en una colaboración próxima mencionaré las diferencias entre el PCR de tiempo Real y el PCR llamado punto final.  

Por ahora, hacemos una pausa.