martes, 27 de marzo de 2018

Fundamentos del funcionamiento de un Ensayo de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Reacción en Cadena de la Polimerasa....¿Cómo funciona un Ensayo de PCR?


PCR por las siglas en inglés significa Reacción en Cadena de la Polimerasa. (Polymerase Chain Reaction).

Como su nombre lo indica, es una reacción de origen biológico, realizada por una enzima (sustancia de naturaleza proteica cada una diseñada para "n" número de funciones metabólicas) llamada Polimerasa.   Esta reacción bioquímica dicho de una manera muy coloquial, equivale a crear o más bien, recrear una copia idéntica de un fragmento de una cadena de  piezas del popular juego LEGO, con bloques complementarios marcados con diferentes colores.

Digamos que la base son cuatro colores: azul(AZ) rojo (/RJ), amarillo(AM) y verde(VR) (segnemto izquierdo) y sus complementos son bloques de colores blanco (BL), negro/(NG), gris (GR) y café (CF) (segnmento derecho)  Tendríamos una cadena de bloques de color AZ-BL; RJ-NG, AM-GR, VR-CF.

Supongamos ahora que tenemos la posibilidad de tener 10,000 bloques individuales combinando los pares anteriores en partes iguales complementarias cada una. Es decir 10,000 entre 8 = 1250 piezas de cada color.  Tendría 2500 bloques de AZ-BL, RJ-NG, AM-GR y VR-CF.  El orden de cada cadena es completamente aleatorio, por lo cual, puedo tener cientos de miles de millones de combinaciones de esta cadena formada por esos bloques.

Toda la descripción anterior, es una analogía del ADN ó Acido Desoxirribonucleico. Este elemento biológico es el maestro de la información genética celular y cada ser vivo sobre la Tierra tiene su propia cadena de ADN que indica qué función y hasta a qué especie pertenece cada ser vivo.

Tiene una estructura de doble hélice con pares complementarios (Adenina-Citosina-Guanina y Timina que se unen respectivamente entre sí como Adenina-Citosina y Guanina.-Timina ó AC, GT) mediante enlaces de hidrógeno).  Un conjunto de ciertas bases agrupado dentro del ADN es lo que forma un GEN ó una expresión biológica de qué controlará o generará dicho segmento de esa cadena, por ejemplo, si una bacteria tendrá una enzima que le permita metabolizar un azúcar ó una proteína o ser resistente a cierto antibiótico, etc.

Debido a la enorme complejidad técnica de lo anteriormente expuesto y que con este escrito estamos buscando que cualquier persona sin importar su grado escolar, pueda entender cómo funciona una reacción de PCR, sigamos comentando qué es lo que ocurre.

Lo que sucede en una reacción de PCR, es que tenemos a la polimerasa (la enzima constructora de los bloques); tenemos el target (o sección de los bloques seleccionados de cual queremos realizar una copia); tenemos el primer (o sección del fragmento de la cadena de ADN (lado izq. ó lado derecho) correspondiente al target buscado y en el caso de la tecnología conocida como PCR de Tiempo Real, tenemos a la sonda (molécula biológica que es una sección o bloque de ADN con 2 moléculas diferentes al inicio y al final, la más importante, la última que tiene una colorida de origen fluorescente).

Durante la reacción de PCR, digamos que queremos saber si en una muestra de un alimento, tengo presencia de la bacteria Salmonella.  Lo que ocurre, es que primero genero una multiplicación de la bacteria en esa muestra pre-enriqueciendo dicho alimento en medio especial. Cuando tenemos por lo menos 10,000 bacterias (1x10-4),  se extrae el ADN del núcleo de la bacteria para dejarlo expuesto calentando a cierta temperatura para dejarlo libre. Los reactivos del PCR es cuando entran en acción.  Se tienen target y primers como parte de la reacción que buscarán o seleccionarán el bloque correspondiente al ADN de la Salmonella. Una vez ubicados y mediante un mecanismo de calentamiento y enfriamiento, la enzima polimerasa empieza a generar copias del target con los primers presentes durante un ciclo de aproximadamente 2 a 4 horas, en fragmentos de 25 hasta 240 segundos, según la capacidad del instrumento o Termociclador que esté realizando los ciclos de temperatura para la duplicación.

En el caso del PCR de tiempo real, la sonda que está dentro del sistema de reactivos, se "pega" a o "adhiere ó une" a los segmentos del target que están siendo multiplicados.  Si se acumula un número suficiente de fragmentos multiplicados, se acumulará una concentración de fluorescencia colorida que puede ser medida por un dispositivo óptico dentro del Termociclador.   Si se formó un nivel de fluorescencia característica durante el período completo de la corrida, se genera una curva que se grafica en tiempo real y permite saber que si alcanza un umbral o nivel mínimo acumulable, quiere decir que el fragmento del ADN deseado en este caso de la Salmonella, sí está o no está presente y nos permite dictaminar si ese alimento presenta contaminación o no, por el germen buscado.

Recordemos que la Reacción en Cadena de la Polimerasa ó PCR, ha generado que se puedan realizar análisis de patógenos por PCR; también se les busca como prueba rápida de PCR ó ensayo rápido de PCR.  Su enfoque comercial más importante hoy por hoy, en análisis de alimentos, es para buscar microorganismos patógenos como Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7 y sus parientes STEC, Cronobacter sakazakii, virus, hongos, diferentes gérmenes nocivos, detección de especie animal y de contaminantes indeseados como clenbuterol, alérgenos, hormonas, etc.

Las siguientes tres gráficas ilustran el proceso de una manera mucho más visual:


Hay muchos detalles técnicos adicionales que se pueden discutir, en una colaboración próxima mencionaré las diferencias entre el PCR de tiempo Real y el PCR llamado punto final.  

Por ahora, hacemos una pausa.





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