Fundamentos del funcionamiento de un Ensayo de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Reacción en Cadena de la Polimerasa....¿Cómo funciona un Ensayo de PCR?

PCR por las siglas en inglés significa Reacción en Cadena de la Polimerasa. (Polymerase Chain Reaction).

Como su nombre lo indica, es una reacción de origen biológico, realizada por una enzima (sustancia de naturaleza proteica cada una diseñada para "n" número de funciones metabólicas) llamada Polimerasa.   Esta reacción bioquímica dicho de una manera muy coloquial, equivale a crear o más bien, recrear una copia idéntica de un fragmento de una cadena de  piezas del popular juego LEGO, con bloques complementarios marcados con diferentes colores.

Digamos que la base son cuatro colores: azul(AZ) rojo (/RJ), amarillo(AM) y verde(VR) (segnemto izquierdo) y sus complementos son bloques de colores blanco (BL), negro/(NG), gris (GR) y café (CF) (segnmento derecho)  Tendríamos una cadena de bloques de color AZ-BL; RJ-NG, AM-GR, VR-CF.

Supongamos ahora que tenemos la posibilidad de tener 10,000 bloques individuales combinando los pares anteriores en partes iguales complementarias cada una. Es decir 10,000 entre 8 = 1250 piezas de cada color.  Tendría 2500 bloques de AZ-BL, RJ-NG, AM-GR y VR-CF.  El orden de cada cadena es completamente aleatorio, por lo cual, puedo tener cientos de miles de millones de combinaciones de esta cadena formada por esos bloques.

Toda la descripción anterior, es una analogía del ADN ó Acido Desoxirribonucleico. Este elemento biológico es el maestro de la información genética celular y cada ser vivo sobre la Tierra tiene su propia cadena de ADN que indica qué función y hasta a qué especie pertenece cada ser vivo.

Tiene una estructura de doble hélice con pares complementarios (Adenina-Citosina-Guanina y Timina que se unen respectivamente entre sí como Adenina-Citosina y Guanina.-Timina ó AC, GT) mediante enlaces de hidrógeno).  Un conjunto de ciertas bases agrupado dentro del ADN es lo que forma un GEN ó una expresión biológica de qué controlará o generará dicho segmento de esa cadena, por ejemplo, si una bacteria tendrá una enzima que le permita metabolizar un azúcar ó una proteína o ser resistente a cierto antibiótico, etc.

Debido a la enorme complejidad técnica de lo anteriormente expuesto y que con este escrito estamos buscando que cualquier persona sin importar su grado escolar, pueda entender cómo funciona una reacción de PCR, sigamos comentando qué es lo que ocurre.

Lo que sucede en una reacción de PCR, es que tenemos a la polimerasa (la enzima constructora de los bloques); tenemos el target (o sección de los bloques seleccionados de cual queremos realizar una copia); tenemos el primer (o sección del fragmento de la cadena de ADN (lado izq. ó lado derecho) correspondiente al target buscado y en el caso de la tecnología conocida como PCR de Tiempo Real, tenemos a la sonda (molécula biológica que es una sección o bloque de ADN con 2 moléculas diferentes al inicio y al final, la más importante, la última que tiene una colorida de origen fluorescente).

Durante la reacción de PCR, digamos que queremos saber si en una muestra de un alimento, tengo presencia de la bacteria Salmonella.  Lo que ocurre, es que primero genero una multiplicación de la bacteria en esa muestra pre-enriqueciendo dicho alimento en medio especial. Cuando tenemos por lo menos 10,000 bacterias (1x10-4),  se extrae el ADN del núcleo de la bacteria para dejarlo expuesto calentando a cierta temperatura para dejarlo libre. Los reactivos del PCR es cuando entran en acción.  Se tienen target y primers como parte de la reacción que buscarán o seleccionarán el bloque correspondiente al ADN de la Salmonella. Una vez ubicados y mediante un mecanismo de calentamiento y enfriamiento, la enzima polimerasa empieza a generar copias del target con los primers presentes durante un ciclo de aproximadamente 2 a 4 horas, en fragmentos de 25 hasta 240 segundos, según la capacidad del instrumento o Termociclador que esté realizando los ciclos de temperatura para la duplicación.

En el caso del PCR de tiempo real, la sonda que está dentro del sistema de reactivos, se "pega" a o "adhiere ó une" a los segmentos del target que están siendo multiplicados.  Si se acumula un número suficiente de fragmentos multiplicados, se acumulará una concentración de fluorescencia colorida que puede ser medida por un dispositivo óptico dentro del Termociclador.   Si se formó un nivel de fluorescencia característica durante el período completo de la corrida, se genera una curva que se grafica en tiempo real y permite saber que si alcanza un umbral o nivel mínimo acumulable, quiere decir que el fragmento del ADN deseado en este caso de la Salmonella, sí está o no está presente y nos permite dictaminar si ese alimento presenta contaminación o no, por el germen buscado.

Recordemos que la Reacción en Cadena de la Polimerasa ó PCR, ha generado que se puedan realizar análisis de patógenos por PCR; también se les busca como prueba rápida de PCR ó ensayo rápido de PCR.  Su enfoque comercial más importante hoy por hoy, en análisis de alimentos, es para buscar microorganismos patógenos como Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7 y sus parientes STEC, Cronobacter sakazakii, virus, hongos, diferentes gérmenes nocivos, detección de especie animal y de contaminantes indeseados como clenbuterol, alérgenos, hormonas, etc.

Las siguientes tres gráficas ilustran el proceso de una manera mucho más visual:

Hay muchos detalles técnicos adicionales que se pueden discutir, en una colaboración próxima mencionaré las diferencias entre el PCR de tiempo Real y el PCR llamado punto final.  

Por ahora, hacemos una pausa.

Ensayos de Flujo Lateral para Determinación de Alérgenos

Ensayos de Flujo Lateral para Determinación de Alérgenos

Hace ya algún tiempo, publicamos la siguiente entrada referente al control de Alergenos en Alimentos, en un blog hermano que llevamos con fines comerciales:
https://serco-microbiologia.blogspot.mx/search?q=aLERGENOS

El día de hoy ahondaremos sobre las metodologías disponibles para control de Alergenos.

Los ensayos para detección de alérgenos se enfocan en detectar por medio de inmunología (Flujo Lateral, ELISA) ó PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) a secciones de las proteínas consideradas como alergénicas.

Existen muchos estudios de todas las gamas de alimentos reconocidas como alergénicas, pero el consenso internacional está enfocado a 8 grandes grupos:
1) Proteínas de la leche (caseína, lactoalbúmina, Beta lactoglobulina)
2) Proteínas del huevo
3) Proteínas del Trigo o granos que contengan Gliadina ó Gluten
4) Proteínas del Cacahuate
5) Proteínas de mariscos y crustáceos e Histamina
6) Proteínas de nueces de árbol (Nuez común, nuez de california, nuez de castilla, nuez de macadamia, nuez de brasil)
7) Proteínas de frutos secos como Avellanas, Almendras, Pistaches
8) Proteínas de mostaza, lupina y sésamo-ajonjolí.

Los fabricantes para este tipo de ensayos que han sido más ampliamente adoptados por la industria de alimentos, son las de flujo lateral.

¿Qué particularidades tienen estos ensayos?
1) Son rápidas, el tiempo total para correr el ensayo oscila entre 8 y 20 minutos totales.
2) Para efectos prácticos, son las únicas que se pueden usar en campo ó a nivel de línea de producción en comparación a las pruebas de ELISA ó de PCR que tienen que llevarse a cabo forzosamente en un laboratorio con equipamiento especializado.
3) No requieren de ningún tipo de dispositivos o equipos para llevarlas a cabo.
4) Son las más conocidas del mercado porque su funcionamiento es equivalente al de las pruebas de embarazo domésticas para las personas.
5) Se consideran  semicuantitativas, porque tienen un nivel mínimo de detección y por ende, si son negativas, garantizan ausencia del alérgeno buscado (en la superficie ó muestra analizada, importante aclaración) a un punto de corte/detección y si son positivas, indican que hay al menos un nivel medible en partes por millón de la molécula alergénica buscada.
6) Sus niveles de detección oscilan entre 1 y 5 partes por millón (ppm) en lo general.
7) Están diseñadas de origen para detección de TRAZAS de alérgenos. Es decir, si una persona quisiera tratar de probarlas con un superficie ó en un producto con más de 1% de contenido de la proteína buscada, se saturan y marcan AUSENCIA.  Se le conoce como efecto Gancho ó Hook.

El funcionamiento de estos ensayos sigue exactamente el mismo principio que describimos en una colaboración previa.   Le invito a que lo pueda revisar en:
http://iso22000yhaccp.blogspot.mx/2018/01/pruebas-de-flujo-lateral-para-analisis.html

Si desea información adicional, nos puede contactar en luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le remitimos con quien corresponda.  En la República Mexicana, se pueden encontrar al menos 4 compañías que cuentan con diferentes marcas comerciales.  El interfecto trabaja en la Dirección Comercial de una de las mismas; sin embargo, es importante que el usuario final que desee implementar un plan de control de alérgenos, exija que la empresa que seleccione, le apoye de principio a fin para dicho plan, con todas las herramientas con la que pueda ser apoyada.

Por ahora, hacemos una pausa.

Breve historia de los Métodos Rápidos para Análisis Microbiológicos de Alimentos, Bebidas, Nutraceúticos y Muestras Ambientales

(Entrada reproducida y adaptada de un Editorial de la Revista Argentina de Microbiología, 2009, escrito por Gerardo Leota).

Métodos rápidos: una herramienta útil y práctica para el análisis microbiológico de los alimentos

Se define como “método rápido” a cualquier método destinado a la detección, el recuento, la caracterización y la subtipificación de microorganismos (patógenos y del deterioro) mediante el cual se obtienen resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los métodos convencionales. 

El desarrollo de métodos rápidos y automatizados constituye un área de la microbiología aplicada muy dinámica y en continua evolución. En las últimas cuatro décadas hubo numerosos avances en el desarrollo de métodos rápidos y desde hace 15 años este campo cobró gran importancia en investigación y en laindustria alimentaria.

Los métodos rápidos se basan en técnicas físico-químicas (películas de medios de cultivos
deshidratados generales o selectivos, sistemas para determinar el número más probable, medios
cromogénicos y fluorogénicos), bioquímicas (galerías miniaturizadas y automatizadas), inmunológicas (precipitación, aglutinación, inmunofluorescencia, citometría, radioinmunoensayo, enzimoinmunoensayo, inmunocromatografía, nefelometría, inmunomicroscopía) y moleculares (hibridación, PCR de punto final, PCR en tiempo real, ribotipificación, microarreglos, biochips).

Desde la década del 70, el desarrollo y la implementación de los métodos rápidos para la identificación de microorganismos evolucionaron en paralelo con los adelantos en otras áreas de la investigación científica, en particular con la generalización del uso de galerías de pruebas bioquímicas miniaturizadas.

A partir de la década del 80, el avance en la producción de anticuerpos monoclonales hizo posible el
desarrollo de pruebas inmunológicas de identificación, como el ELISA o la inmunocromatografía. En
1990, con el advenimiento de las técnicas de biología molecular comenzaron a utilizarse técnicas como la PCR, tanto para tamizaje como para la identificación de microorganismos y sus factores de virulencia.

A partir del año 2000, comenzó el desarrollo de biosensores y en menor medida de biochips y microarreglos.

El crecimiento exponencial de los métodos rápidos aplicados a la microbiología de los alimentos puede evidenciarse en la gran cantidad de equipos comerciales que se ofrecen en la actualidad con el objetivo de tener resultados rápidos, en tiempo real, exactos y de bajo costo. Por ejemplo, como consecuencia de la automatización, el estudio de genotipos bacterianos pasó de ser un proceso tedioso y lento a un método práctico que se puede aplicar en los ensayos microbiológicos cotidianos.

Al cierre de 2014, siguen existiendo avances en la automatización de los ensayos rápidos y la tendencia mundial es clara, los métodos y análisis rápidos continuarán evolucionando según los avances tecnológicos en la miniaturización y automatización lo permitan.

Según el Dr. Daniel C. Fung, la mayor autoridad mundial en metodologías y pruebas de Microbiología Rápida y Automatizada, ha predecido que llegará un día en que podamos hacer detecciones de microorganismos en tiempo real, ya sea en segundos o minutos y cada día la ciencia nos está acercando hacia el cumplimiento de dicha predicción.

Por ahora, hacemos una pausa.

Para aplicaciones de microbiología rápida con aprobaciones AOAC-OMA, una de las opciones de consulta es:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109652.htm (Documento archivado desde 2001 en el Manual de Bacteriología Analítica).

Criterios de Selección para un equipo de PCR ó Biología Molecular para Análisis de Alimentos

En nuestro diario contacto con empresas de alimentos, mucha gente nos pregunta cuáles son o debieran ser los criterios para la selección de un equipo de PCR para análisis de alimentos; considerando que es una tecnología que todavía es de alto costo de inversión inicial.

Desarrollamos un cuestionario que puede serle útil para diferenciar entre cualquier opción de mercado que usted llegue a seleccionar y que si está en proceso de búsqueda, las considere para una toma de decisiones más informada.

Lo que debe preguntar/indagar es:
1) ¿Qué es lo que usted como usuario entiende por un método molecular?
2) ¿Cuál es la diferencia entre un método molecular ó un método de PCR?
3) ¿Qué gobierno en el mundo con una autoridad sanitaria reconocida como USDA-FDA (EEUU) ó Health Canada ó Nueva Zelanda ó Australia ó algún país de la CEE está empleando YA el equipo que está considerando comprar/evaluar?
4) ¿Qué es lo más importante para ud. cuando hace un monitoreo de patógenos por PCR?
5) ¿Qué tanta grasa tienen las matrices de los productos que analizará por PCR?
6) ¿Qué tanta clorofila tienen las matrices de los productos que analizará por PCR?
7) ¿Qué tantos compuestos antioxidantes tienen las matrices de los productos que analizará por PCR?
8) ¿Alguna de sus matrices incluye especias como paprika, cebollo, ajo, pimienta, laurel, comino o alguna otra? Todas son inhibidoras conocidas de la reacción de PCR.
9) ¿Qué tan frecuente las matrices que llegue a analizar por PCR tienen o tendrían presencia de coliformes totales?
10) ¿Qué tan frecuente las matrices que llegue a analizar por PCR tienen o tendrían presencia de bacterias como Proteus, Citrobacter ó E.coli?
11) ¿Cuánta muestra efectiva desea inocular en los tubos de amplificación en los tubos de PCR?
12) ¿Cómo puede asegurar en el método de PCR/Molecular que un negativo es realmente un negativo y que tenga documentación que ampare esta situación?
13) ¿Qué nivel de sensibilidad tiene el método de PCR que esté considerando?
14) ¿Qué estudio(s) tiene el proveedor(es) de ese método que avale la sensibilidad?
15) ¿Qué porcentaje de falsos positivos tiene el método de PCR que esté considerando?
16) ¿Qué porcentaje de falsos negativos tiene el método de PCR que esté considerando?
17) ¿Qué empresas de las 10 más reconocidas en el mundo del área de alimentos ya están usando el método de PCR que desea considerar/evaluar?
18) ¿Qué mantenimiento necesita el equipo de PCR que desea considerar/evaluar?
19) ¿Qué soporte local le puede ofrecer la empresa que distribuye o vende la tecnología de PCR?
20) ¿Qué tan importante es un TTR (Tiempo Total de Resultados) para bacterias como Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7 ó E.coli -STEC Big Six sea menor a 1 día ó de 8 a 12 horas?
21) ¿Cuántas matrices consideró para la validación  de los diferentes patógenos como Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, E.coli-STEC Big Six u otras tiene el método de PCR?
22) ¿Incluye o tiene algún sistema para purificar la muestra antes de procesarla?  Se ha ido expandiendo el uso de la IMS u otras tecnologías para purificar y concentrar la muestra en los últimos 5 a 10 años.
23) ¿Qué nivel de concentración Log requiere en sus matrices tras el pre-enriquecimiento para que pueda ser detectada por el sistema de reactivos y equipo de PCR en evaluación?
24) ¿Cuál es el tiempo de caducidad de los kits que maneja el proveedor de PCR?
25) ¿Cómo se calibra el termociclador que tiene el proveedor de PCR?
26) ¿Qué interferencias conocidas sabe el proveedor que tiene la tecnología que le esté ofreciendo?
27) ¿Tiene ya alguna validación para los kits que maneje el equipo tales como AOAC-OMA ó MicroVal ó AFNOR o similares?
28) ¿Cuántas muestras puede correr por día?
29) ¿El equipo es escalable? ¿Tiene opciones para hacerlo crecer en # de análisis?
30) ¿El equipo de PCR tiene capacidades Multiplex?
31) ¿El equipo de PCR puede correr muestras simultáneas de diferentes patógenos?
32) ¿El equipo de PCR produce señales de indeterminados, no amplificados ó alguna otra que requiera que las muestras se tengan que repetir?
33) ¿Qué tipo de sondas utiliza el equipo de PCR para la detección del patógeno buscado?
34) ¿Qué tan robusto es el equipo para uso rudo o de muchas muestras?
35) ¿Qué tipo de sistema de enfriamiento y calentamiento utiliza?

Estas son algunos de los cuestionamientos más representativos que le pueden ser de utilidad para evaluar una metodología de PCR para análisis de patógenos.

Esperemos que le puedan ser de utilidad.

Por ahora, hacemos una pausa.

Análisis de Salmonella en 12 horas (siempre buscado, finalmente alcanzado)

Después de una enorme pausa en actualizar el presente blog, ahora comparto una noticia realmente de avanzada para el campo de la microbiología de alimentos: El monitoreo de la bacteria Salmonella en tan sólo 12 horas para Tiempo Total de Resultados (un auténtico análisis o método rápido).

El método tradicional, que sigue existiendo y está referenciado en la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS, próxima a ser reemplazada por el PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-210-SSA1-2013, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y toxinas microbianas, sigue requiriendo el largo, tedioso y complicado proceso de aislamiento del patógeno Salmonella,  con los mismos pasos de siempre:
1) Pre-enriquecimiento x 24 horas
2) Enriquecimiento selectivo x 24 horas adicionales
3) Aislamiento selectivo en agar diferencial x 24 horas adicionales
4) Pruebas bioquímicas presuntivas x 24-48 horas adicionales
5) Pruebas bioquímicas confirmativas x 24-72 horas adicionales
6) Puebas de identificación serológica x 24-72 horas adicionales

Tiempo total de resultados: 7 a 9 días.

Si para el procesador actual, un día es mucho tiempo, imaginémonos cuánto son al menos 4 a 5 días para estar seguros que realmente no es una bacteria Salmonella, la que está en nuestro producto o en las superficies de nuestras instalaciones.

Por muchos años, la comunidad científica y las empresas especializadas en ensayos rápidos, especialmente aquellas enfocadas a Biología Molecular y más específicamente, las que han desarrollados kits o ensayos del método conocido como Reacción En Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction, por las siglas en inglés), las que han estado buscando reducir el tiempo de análisis durante la última década.

 Existen varias compañías en el mercado que ya tienen kits de PCR para Salmonella, pero el tiempo más rápido logrado hasta ahora con reconocimiento oficial es de 20 horas (por la cía. Biocontrol Systems con su Assurance GDS para Salmonella).  La empresa que inició y popularizó la tecnología de PCR para el sector industrial de alimentos y laboratorios de pruebas, DUPONT Qualicon, con la tecnología BAX, tiene kits que demoran entre 24 y 30 horas, según el protocolo de enriquecimiento acorde a la matriz alimentaria utilizada y ha desarrollado un kit de PCR de tiempo real en menor tiempo que está en proceso de pruebas y futura liberación, posiblemente dentro del siguiente año calendario.

En el caso específico de esta entrada del Blog, me quiero referir a la Tecnología Assurance GDS para Salmonella (que dicho sea de paso, la empresa para la que presto mis servicios profesionales, es distribuidor autorizado para la República Mexicana) en un plan 100% técnico y que sean los lectores y usuarios finales quienes vean si esta tecnología les puede o no ayudar para sus planes de monitoreo microbiológico; sin embargo, para que un ensayo de Salmonella se pueda considerar realmente como un ensayo, método, metodología o prueba rápida, el estándar a vencer al momento presente son 24 horas o menos.

Lo que incluye la tecnología es:
* Sistema de reactivos con control interno, sonda, primers y Enzima Polimerasa incluida
* Tiempo de preparación con proceso acoplado de InmunoSeparación Magnética (IMS)
* Equipo de PCR desarrollado por Qiagen, Rotor-Q, que cuenta con opción para corridas de 36 o hasta de 72 ensayos por corrida.  Comercialmente, el equipo se vende como Termociclador Assurance GDS, de plataforma cerrada para los ensayos desarrollados por Biocontrol Systems.
* Protocolo de enriquecimiento acorde al Manual de Bacteriología Analítica, basado en Agua Peptonada Bufferada de 18 a 22 horas totales, universal para más del 99% de las muestras, excepto en leche descremada en polvo o similares que requieren Agua Verde Brillante.
* Protocolo de enriquecimiento recién liberado por Biocontrol y en vías de ser considerado como una Modificación Menor en el proceso, de manera que la tecnología seguiría conservando su estatus como AOAC Official Method of Analysis 2009.03, usando un medio propietario mEHEC, que también es usado para pruebas de E.coliO157:H7 y las TopSTEC (Big Six); en sólo 8 a 10 horas.
* Tiempo total de resultados con APB:  20 horas mínimo.
* TIEMPO TOTAL DE RESULTADOS CON mEHEC:  10 a 12 horas

¿Cómo ha logrado reducir tanto los tiempos desde 7-9 días a tan sólo medio día?

•  Usando el proceso de IMS que concentra la muestra en tan sólo 20 minutos y que limpia la muestra de microorganismos que interfieren o causan reacción cruzada en el aislamiento diferencial

•  Usando la sensibilidad-nivel de detección típica de un buen termociclador de sólo 1000 a 10,000 células vegetativas, en vez del 1,000,000 a 10,000,000 que requiere el método tradicional o métodos inmunológicos rápidos de ELISA, flujo lateral, ELFA, etc.

• Utilizando la Sonda MGBH Eclipse que incrementa exponencialmente los resultados y la precisión para la detección de los fragmentos del ADN que se reproducen duranta la reacción propia de PCR

• Utilizando un  medio enriquecido con suplementos especiales que ayudan al rápido desarrollo de los microorganismos objetivo de manera altamente selectiva.

Para cualquier lector interesado en saber más detalles, puede consultar los siguientes vínculos:

http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs

http://www.biocontrolsys.com/products/view/salmonela
http://www.biocontrolsys.com/news/view/new-8-hour-enrichment-for-assurance-gds

Seguiremos informando.
 

Tecnología de PCR para detección de patógenos

Después de una pequeña pausa, empezaremos a comentar con una frecuencia al menos semanal, de los tópicos que nos llevaron a crear este blog.

El tema de hoy es La Tecnología de PCR para detección de patógenos.

Desde los primeros tiempos en que empezaba la microbiología como la conocemos hoy, hacia finales del siglo XIX, con las investigaciones del Dr. Pasteur, el Dr. Koch, Samuel Petri, el Dr. Salmon y muchos renombrados individuos que pueden ser considerados como los iniciadores y que dejaron su huella para la posteridad, el ser humano se ha visto en la creciente necesidad de buscar encontrar, detectar y monitorear los seres biológicos invisibles que hoy en día conocemos a nivel genérico como microorganismos o microbios.

Este fascinante mundo, que en términos reales fueron los que primeros seres vivos que existieron sobre la Tierra (por ser la mayoría de ellos seres vivos unicelulares ó conformados por una sola célular) sigue siendo tema de estudio permanente desde esos tiempos y afortunadamente para la raza humana, se han seguido mejorando notablemente las diferentes metodologías de análisis para poder dictaminar su existencia hasta género y especie.

Hablando en términos específicos para monitoreo de microorganismos patógenos, como los que hemos hablado en temas anteriores, específicamente para tres de los microorganismos que más enfermedades causan en el ser humano y que son transmitidos mayoritariamente por consumo o ingesta de alimentos contaminados, a saber: Salmonella, Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7 (EHEC) existen tres grandes grupos de pruebas para detectarlos:

1) Microbiología tradicional en agares, caldos y serología.

2) Detección inmunológica rápida por anticuerpos en varios formatos:
Formatos de ELISA
Formatos de Inmunoprecipitación en Látex
Formatos de Inmunodifusión
Formatos de Inmunocaptura Magnética

3) Detección mediante Análisis del Material Genético de los microbios usando la tecnología de PCR (Polimerase Chain Reaction) ó de Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés.

En esta entrega del blog, comentaremos con cierto detalle qué es el PCR.

En términos muy entendibles, recordemos que todos los seres vivos y los virus (que no se consideran a nivel biológico como seres "vivos" en toda la extensión de la palabra, pero que son entes biológicos o seres que tienen características especiales) están constituidos de varios sistemas que mantienen las células que los conforman. En todos los casos, la estructura biológica por excelencia encargada de darle la "forma" a cada ser vivo, es el Acido Desoxirribonucleico o ADN (DNA en inglés). Este componente, se encuentra en los cromosomas de cada ser vivo y en el núcleo de cada microorganismo.

El ADN, es 100% único para cada ser vivo. Al ser formado por una cadena de 4 moléculas llamadas nucleótidos con sus respectivos pares complementarios y que forma una cadena o doble hélice con tramos tan cortos como 100 pares hasta varios millones, como en algunos genes humanos, existen trillones de combinaciones en esa cadena. Por la misma razón, pueden existir trillones de individuos con características totalmente distintas entre sí.

La tecnología de PCR ha tomado ventaja de esa peculiaridad del ADN y por medio del aislamiento de una parte o sección de la cadena de doble hélice, mediante un dispositivo biológico llamado Sonda y con la ayuda de una enzima especial conocida como TAQ POLIMERASA, cuya función es crear un número indeterminado de copias de fragmentos del ADN creando polímeros o copias idénticas de los los mismos, ha revolucionado por completo el mundo diagnóstico creando de facto, la disciplina que hoy llamamos Biología Molecular.

Los elementos que requiere esta tecnología son:
1) Primers
2) Sonda
3) Target u Objetivo
4) Taq Polimerasa
5) Termociclador de punto final ó de Tiempo Real
6) Sistema para detectar las copias al final (Electroforesis en gel, curvas de fusión por fluorescencia, curvas de producción de copias marcadas con fluorescencia (PCR Tiempo Real)
7) Control interno

Cada uno de los elementos cumple con una función específica:
1) Los primers es la secuencia específica de nucleótidos del ADN que son específicos del organismo que estamos tratando de detectar.

2) La sonda, que en el caso de los sistemas de Tiempo real suele ir marcada en los extremos, con un elemento conocido como Quencher (o amortiguador) y con otro que es un agente Fluorogénico o Fluoróforo. Se puede describir como una sección complementaria para los primers del microorganismo que estamos buscando detectar.

3) El target u objetivo es la secuencia simple complementaria a la que la sonda se unirá para generar su duplicación "n" veces en el ciclo que llamamos amplificación.

4) La Taq Polimerasa, es una enzima aislada del microorganismo Thermus aquaticus, encontrado en las fuentes termales de Yellowstone, Estados Unidos. Esta enzima es la responsable de generar copias o formar "polímeros" del target u objetivo, si tiene las condiciones necesarias de temperatura, acidez y oligoelementos como el cloruro de magnesio en una solución acuosa.

5) El termociclador es un dispositivo diseñado para generar de manera alterna condiciones de temperatura en rangos de 55 hasta 95°C, que permiten que la Taq Polimerasa pueda cumplir con su función de generado de copias o "amplificar" el ADN. Existen dos tipos básicos: Los de gradiente de temperatura en bloque sólido (aquí entran los de compañías como Applied Bioresearch, los de Qualicon, BioRad y otros más) y los rotativos (como el RotorGiene de Corbett Research, ahora de QIAGEN y los LightCyclers de Roche). Normalmente corren 40-50 ciclos en períodos desde 60 segundos hasta poco menos de 5 minutos; por lo cual el proceso de termociclado demora desde 45 mins hasta 3-4 horas.

6) El sistema más usado para detectar las copias generadas hasta hace poco menos de 20 años eran los sistemas de electroforesis en gel; en los últimos 10 años, surgió con más fuerza el uso de fluoróforos como el SYBR-GREEN, para poder medir la curva de fusión de los ciclos de amplificación y en los últimos 5 años, ha tomado más fuerza el uso de equipos termocicladores Tiempo Real, que usan fluoróforos altamente específicos y selectivos, que permiten incluso cuantificar concentraciones en función de las curvas de generación de la fluorescencia (en todos los casos anteriores, el termociclador tiene acoplado el sistema para detectar el SYBR-Green u otros fluoróforos; sólo para la electroforesis en gel se hace en equipos por separado).

7) El uso de controles internos se ha extendido cada vez más para demostrar, comprobar, verificar y validar al mismo tiempo que realmente ocurrió la reacción de amplificación. Estos suelen añadirse en los tubos de reacción o en los capilares que se introducen en el termociclador.

Para terminar esta descripción general sobre la Tecnología de PCR, cabe señalar que son cada vez más las empresas de todo tipo a nivel mundial y especialmente aquellas que elaboran productos sensibles a nivel microbiológico como las de alimentos congelados para consumo inmediato (RTE por las siglas en inglés), de alimentos para niños y/o fórmulas nutricionales, empresas de cárnicos procesados, empresas de productos lácteos frescos y procesadoras de alimentos orgánicos, las que han adoptado el uso comercial de esta tecnología.

Si usted está realmente interesado en alguna, busque que incluya preferentemente algun sistema de concentración de la muestra mediante un proceso como la Inmunoseparación Magnética (IMS en inglés), que es la tendencia de esta tecnología. Usar IMS acoplada con PCR Tiempo Real para buscar resultados en mucho menor tiempo de lo que tarda el método tradicional o pruebas inmunológicas como las que mencionamos anteriormente.

Actualización al Mes de Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs

Metodología para análisis de Salmonella

Métodos para detección de Salmonella en alimentos y bebidas.

Acorde al manual de bacteriología analítica (BAM) de los Estados Unidos, la norma oficial mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de salmonella en alimentos y la metodología de otros países como la Comunidad Económica Europea, el usar métodos de cultivo tradicionales sigue siendo la referencia más importante para la detección de microorganismos de interés sanitario para el ser humano.

Todos los métodos para detección de patógenos, involucran en mayor o menor grado las siguientes etapas:

1) Pre-enriquecimiento

2) Enriquecimiento Selectivo

3) Aislamiento Diferencial

4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas

5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas

6) Serología con anticuerpos específicos

Cada una de las etapas anteriores tiene una duración mínima de 24 a 48 horas, lo cual lleva a terminar el ensayo o análisis del patógeno en períodos no menores a 7 días en la mayoría de los casos. Para Salmonella, específicamente serían 9 días.

¿Cuál es el objetivo de cada una de las etapas?

Las describiremos brevemente a continuación.

1) El pre-enriquecimiento tiene como objetivo el desarrollo general de microorganismos del tipo similar a aquél que estamos buscando que se desarrollen por lo menos 2 o 3 logaritmos. Todos aquellos microorganismos que no son del mismo grupo (en el caso de Salmonella, aquellos diferentes al grupo Enterobacteriaceae) suelen ser inhibidos o tienen crecimiento marginal durante este paso. Los caldos más usados suelen ser el Lactosado, el Agua Peptonada Bufferada y el Caldo Soya Tripticaseína.

2) El enriquecimiento selectivo (E.S.) como su nombre lo indica, es buscar llevar a un nivel cercano al 1,000,000 de m.o./mL (10 a la 6) y neutralizar eficazmente a otros miembros que puedan tener un desarrollo similar en la microflora del alimento que se está analizando. En el caso específico de Salmonella, durante esta etapa se busca desarrollarla por encima de bacterias coliformes como E.coli, Citrobacter y Proteus. En esta etapa suelen usarse caldos selectivos como el Tetrationato, el Rappaport Vassiliadis y el Selenito Cistina.

3) Durante el aislamiento diferencial, se toma una asada del medio de E.S. y se re-siembra por estriado en una sola placa o máximo en la mitad de una placa de petri regular. El estriado debe ser lo suficientemente espaciado para que al término del mismo, puedan llegarse a seleccionar colonias puntiformes que puedan ser aisladas para el siguiente paso. Para el análisis de Salmonella, existen más de 5 formulaciones de agar ampliamente usadas entre los que están el Agar Entérico Hektoen, el Agar Verde Brillante, el Agar de Sulfito Bismuto, el Agar McConkey, el Agar XLD y el Agar Salmonella Shigella.

4) Las pruebas bioquímicas presuntivas se enfocan a buscar ciertas características bioquímicas relacionadas con motilidad o desarrollo de algún color, turbidez o precipitación sobre un agar o un caldo selectivo en tubo. Estas pruebas permiten descartar si bacterias con un desarrollo en agar muy parecido a la bacteria objetivo (para Salmonella, bacterias como Proteus vulgaris, E.coli y Citrobacter freundii y determinar en esta etapa si conviene continuar a la búsqueda del género y especie del microorganismo en el siguiente paso. Para Salmonella, los dos ensayos analíticos más comunes incluyen el uso del Agar Triple Azúcar Hierro (TSI) y el Agar Lisina Hierro (LIA).

5) Las pruebas bioquímicas confirmativas, acorde al manual de Bergley´s, son el conjunto de análisis específicos para determinación de género y especie de los microorganismos. Estas incluyen pruebas como el indol, Citrato de Simmons, Manitol, Urea, Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Acorde a los resultados de cada una de ellas, se determinan la identidad del microorganismo.

5) La Serología, usa Antisueros específicos para cada microorganismo que indican el detalle exacto de las características bioquímicas y fisiológicas. Casi todas ellas son por aglutinación en látex y suelen demorar de 1 a 3 días.

Cada uno de los ensayos anteriores, se puede consultar con más detalle acorde a BAM y la norma oficial mexicana de Salmonella en los siguientes hipervínculos:

www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html

www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/114ssa14.html

Lo comentado con anterioridad aplica de manera exclusiva para el análisis microbiológico oficial de Salmonella acorde al BAM o la NOM-114 en México. Existen algunas alternativas que pueden ser opciones para empresas interesadas en hacer un "screening" o monitoreo presuntivo de la bacteria con fines comerciales y de liberación de producto terminado ó materias primas así como monitoreos ambientales de superficies inertes y vivas.

En un archivo subsecuente hablaremos con detalle sobre ellas, por ahora sólo mencionaremos los formatos:

1) Inmunoprecipitación en látex

2) Inmunodifusión en agar y captura de anticuerpos

3) Ensayos inmunoenzimáticos tipo "sandwich" o de ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay)

4) Hibridación de RNA

5) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por las siglas en inglés

6) Inmunocaptura magnética (proceso conocido como IMS)

Continuaremos más adelante.

Información agregada en Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs