Cómo funciona un ensayo de sustrato cromogénico para análisis microbiológico

Principios y Fundamento del funcionamiento de los ensayos de sustrato cromogénico en Microbiología

Continuando con esta serie de colaboraciones semanales, abordaremos ahora un interesante tema de una tecnología que se ha vuelto bastante reconocida y popular en este siglo y que fue desarrollada hacia finales de los años 70, es decir, alrededor de 40 años atrás (se escribe esta entrada el 23 de Enero de 2018).

¿Qué es la tecnología, cómo funciona y para qué sirve?

El nombre de la Tecnología nos dá una idea general de la misma:  Tecnología de Sustrato Cromogénico.  Es una técnica analítica usada en Microbiología para detección, identificación y cuantificación de diferentes microorganismos de interés para el ser humano, incluyendo bacterias indicadoras como los mesófilos aerobios, los coliformes totales, los hongos y levaduras así como otras de naturaleza patógena para humanos y animales incluyendo gérmenes como Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, bacterias E.coli TOP STEC, Cronobacter sakazakii,  Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus y muchas más.

La manera en la que funciona esta tecnología incluye un sustrato con propiedades cromogénicas.  Este sustrato suele ser una molécula con 2 componentes: Un compuesto enlazado a una fracción que al desprenderse en una solución, desarrolla color (El complejo cromogénico es incoloro cuando está completo; cuando se separa en 2, una de las secciones es una molécula cromógena o formadora de un color específico que puede ser rojo malva, azulado, verde, amarillo, rojo intenso, café y una variedad de colores adicionales).

Funciona para detección de bacterias, hongos y levaduras porque aprovecha que cada microorganismo ó grupo de estos tiene enzimas metabólicas que son propias del género, del grupo o de la especie.  Algunas de estas enzimas pueden metabolizar ciertos sustratos incoloros y cuando liberan el cromógeno, la solución ó la colonia (si estuviere en una placa de agar) precipitan y desarrollan una coloración altamente característica.

Un ejemplo clásico es un sustrato conocido como CPRG ó Rojo de Fenilo Beta-D-Galactopiranósido) y el CPRG-MUG (Rojo de Fenil Umbeliferil Beta-D-Glucurónido).

Este se usa para detectar coliformes totales y E.coli (las 2 en uno).  Las coliformes totales tienen la enzima Beta-D-Galactosidasa que metaboliza el CPRG (en solución es amarillo) y cuando eso ocurre, el rojo de fenil ligado se convierte en rojo de fenilo que precipita de un color rojo característico ó tiñe la solución si fuera en una muestra de agua.    De manera simultánea, si existe E.coli dentro de la misma muestra,  esta última tiene la enzima Beta-D-Glucoronidasa, que metaboliza el CPRG-MUG y desprende la metil umbeliferona, que es una molécula fluorogénica (produce fluorescencia visible bajo luz ultravioleta de 350 a 365 nanómetros de longitud de onda).

Esta tecnología se ha usado en diferentes ensayos rápidos o complementarios para identificación, detección y cuantificación bioquímica de diferentes bacterias, hongos y levaduras.  

Sus ventajas más importantes incluyen:

* Facilidad para la interpretación

* Costos sumamente competitivos

* Incrementa de manera considerable la especificidad

* Disminuye la necesidad de buscar colonias por morfología

* No depende de colorantes que tienen diferentes matices por el pH del medio o la muestra

* Permite el uso de múltiples sustratos en una placa de agar para detección de diferentes microorganismos como parte de una muestra, simplificando el tiempo, recurso económico y esfuerzo para la detección y/o identificación del germen buscado

* Hoy por hoy es una tecnología que ha sido validada prácticamente por 4 décadas

Existen diferentes empresas de renombre mundial que la han incorporado tanto a formulaciones de agar como a formulaciones líquidas que se pueden usar para contabilización de bacterias y/o  para formatos de Número Más Probable ó de Presencia-Ausencia de microorganismo.

Si desea información adicional de cómo puede usted beneficiarse de esta tecnología en su empresa o laboratorio, mándenos un correo-e ó un mensaje escrito al celular (52)8119990225 y con gusto le canalizamos con quien le pueda ayudar y mostrarle en vivo y a todo color cómo puede usted obtener dichos beneficios.

Por ahora hacemos una pausa...

Metodología para análisis de Salmonella

Métodos para detección de Salmonella en alimentos y bebidas.

Acorde al manual de bacteriología analítica (BAM) de los Estados Unidos, la norma oficial mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de salmonella en alimentos y la metodología de otros países como la Comunidad Económica Europea, el usar métodos de cultivo tradicionales sigue siendo la referencia más importante para la detección de microorganismos de interés sanitario para el ser humano.

Todos los métodos para detección de patógenos, involucran en mayor o menor grado las siguientes etapas:

1) Pre-enriquecimiento

2) Enriquecimiento Selectivo

3) Aislamiento Diferencial

4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas

5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas

6) Serología con anticuerpos específicos

Cada una de las etapas anteriores tiene una duración mínima de 24 a 48 horas, lo cual lleva a terminar el ensayo o análisis del patógeno en períodos no menores a 7 días en la mayoría de los casos. Para Salmonella, específicamente serían 9 días.

¿Cuál es el objetivo de cada una de las etapas?

Las describiremos brevemente a continuación.

1) El pre-enriquecimiento tiene como objetivo el desarrollo general de microorganismos del tipo similar a aquél que estamos buscando que se desarrollen por lo menos 2 o 3 logaritmos. Todos aquellos microorganismos que no son del mismo grupo (en el caso de Salmonella, aquellos diferentes al grupo Enterobacteriaceae) suelen ser inhibidos o tienen crecimiento marginal durante este paso. Los caldos más usados suelen ser el Lactosado, el Agua Peptonada Bufferada y el Caldo Soya Tripticaseína.

2) El enriquecimiento selectivo (E.S.) como su nombre lo indica, es buscar llevar a un nivel cercano al 1,000,000 de m.o./mL (10 a la 6) y neutralizar eficazmente a otros miembros que puedan tener un desarrollo similar en la microflora del alimento que se está analizando. En el caso específico de Salmonella, durante esta etapa se busca desarrollarla por encima de bacterias coliformes como E.coli, Citrobacter y Proteus. En esta etapa suelen usarse caldos selectivos como el Tetrationato, el Rappaport Vassiliadis y el Selenito Cistina.

3) Durante el aislamiento diferencial, se toma una asada del medio de E.S. y se re-siembra por estriado en una sola placa o máximo en la mitad de una placa de petri regular. El estriado debe ser lo suficientemente espaciado para que al término del mismo, puedan llegarse a seleccionar colonias puntiformes que puedan ser aisladas para el siguiente paso. Para el análisis de Salmonella, existen más de 5 formulaciones de agar ampliamente usadas entre los que están el Agar Entérico Hektoen, el Agar Verde Brillante, el Agar de Sulfito Bismuto, el Agar McConkey, el Agar XLD y el Agar Salmonella Shigella.

4) Las pruebas bioquímicas presuntivas se enfocan a buscar ciertas características bioquímicas relacionadas con motilidad o desarrollo de algún color, turbidez o precipitación sobre un agar o un caldo selectivo en tubo. Estas pruebas permiten descartar si bacterias con un desarrollo en agar muy parecido a la bacteria objetivo (para Salmonella, bacterias como Proteus vulgaris, E.coli y Citrobacter freundii y determinar en esta etapa si conviene continuar a la búsqueda del género y especie del microorganismo en el siguiente paso. Para Salmonella, los dos ensayos analíticos más comunes incluyen el uso del Agar Triple Azúcar Hierro (TSI) y el Agar Lisina Hierro (LIA).

5) Las pruebas bioquímicas confirmativas, acorde al manual de Bergley´s, son el conjunto de análisis específicos para determinación de género y especie de los microorganismos. Estas incluyen pruebas como el indol, Citrato de Simmons, Manitol, Urea, Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Acorde a los resultados de cada una de ellas, se determinan la identidad del microorganismo.

5) La Serología, usa Antisueros específicos para cada microorganismo que indican el detalle exacto de las características bioquímicas y fisiológicas. Casi todas ellas son por aglutinación en látex y suelen demorar de 1 a 3 días.

Cada uno de los ensayos anteriores, se puede consultar con más detalle acorde a BAM y la norma oficial mexicana de Salmonella en los siguientes hipervínculos:

www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html

www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/114ssa14.html

Lo comentado con anterioridad aplica de manera exclusiva para el análisis microbiológico oficial de Salmonella acorde al BAM o la NOM-114 en México. Existen algunas alternativas que pueden ser opciones para empresas interesadas en hacer un "screening" o monitoreo presuntivo de la bacteria con fines comerciales y de liberación de producto terminado ó materias primas así como monitoreos ambientales de superficies inertes y vivas.

En un archivo subsecuente hablaremos con detalle sobre ellas, por ahora sólo mencionaremos los formatos:

1) Inmunoprecipitación en látex

2) Inmunodifusión en agar y captura de anticuerpos

3) Ensayos inmunoenzimáticos tipo "sandwich" o de ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay)

4) Hibridación de RNA

5) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por las siglas en inglés

6) Inmunocaptura magnética (proceso conocido como IMS)

Continuaremos más adelante.

Información agregada en Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs