Monitoreo ambiental en su Planta. ¿Qué hago ahora con los resultados?

"Qué hacer con  sus resultados de monitoreo ambiental de patógenos e indicadores"

La presente información que me permito compartir en esta entrada, surgió como una motivación después de leer a un par de expertos de Merieux Nutrisciences (Jeniffer Johson, Consultora Técnica y  Tim Freier, Vicepresidente de la División de Ciencias, Asuntos Regulatorios y Microbiología).

En una entrada reciente del mes de Enero de 2018, comentamos sobre los "Swab-a-Thons" que están llevando a cabo en los Estados Unidos de América, por parte de la FDA, para hacer mapeos de la presencia de patógenos en las plantas de alimentos (re-leer https://iso22000yhaccp.blogspot.mx/2018/01/la-importancia-del-monitoreo-de.html).

Algo que no mencionamos en dicha entrada, es que la FDA tiene la consigna de hacer secuienciación genética completa de los microorganismos encontrados, que no es otra cosa que obtener una huella identificatoria única de cada uno, al nivel de tenerlos en un archivo de "criminales más buscados" para que si llega a presentarse un delito, en este caso, un brote de enfermedad transmitida por alimentos, se pueda hacer una comparación del germen aislado vs. los registros de la base de datos que está construyendo la FDA.

Me permito compartir algunos puntos clave de cómo abordar el tema de los resultados que obtenga de su programa de análisis microbiológicos, incluyendo sus propios "Swab-a-thons" de control interno.

1) Debe realizar un mapa con el layout o la distribución geográfica de su planta en las 4 zonas de monitoreo recomendados por la FDA.

Zona 1 : Superficies de contacto directo con producto (rebanadoras, bandas, peladoras, tablas de corte, deshuese u otros procesos, utensilios, carros, mesas de trabajo).

Zona 2 :  Areas exteriores de los equipos, unidades de enfriamiento, carcazas ó contenedores, marcos, pisos).

Zona 3 :  Transportadores, cabinas, montacargas, drenajes, pisos de áreas no críticas.

Zona 4 :  Area de vestidores, pasillos, áreas de reunión, cafetería.

2) La información del mapa previo, es conveniente superponerla con patrones de tráfico de personal, movimiento o flujo del proceso de producción, ubicación de los drenajes, ubicación de las tuberías, etc.  de manera que pueda hacer un cruce informativo de causas y efectos, en relación al monitoreo de microorganismos indicadores, pero especialmente de patógenos.

3) Evaluar patrones de presencia y acumulación de humedad, especialmente en las zonas 1 y 2.  Es muy importante que considere las observaciones del personal de mantenimiento. Recuerde que la presencia de humedad suele asociarse con Listeria y lugares secos por mucho tiempo, con formación de polvo, con la de Salmonella.

4) Realice un análisis estadístico de la temporalidad con la que ha encontrado positivos. ¿Es en una época específica del año?  ¿Están ligados a un turno en particular? ¿Ocurren con más frecuencia con algún proceso donde involucre materias primas con  mayor riesgo de contaminación cruzada? ¿Se asocian con  movimientos de personal clave perteneciente al área de Sanidad, Aseguramiento de Calidad ú Operaciones?  ¿Ocurren en períodos de alta o de baja producción?

5) Finalmente, es importante que involucre a un equipo multidisciplinario para el análisis de sus conclusiones. Esto debe incluir personal de producción, calidad, mantenimiento, operaciones, laboratorio e incluso auditores externos para que le apoyen en la identificación e implementación de acciones correctivas ó preventivas con suficiente anticipación.      

El factor más importante a considerar es que si toma suficientes mediciones y análisis de monitoreo ambiental, difícilmente estará  a ciegas cuando llegare a  presentarse un problema de contaminación en producto terminado y le permitirá hacer un control de daños mucho más rápido, efectivo y eficaz que si sólo tiene unos cuantos resultados dispersos, con poca frecuencia y representatividad de la situación que viven en sus instalaciones cada mes del año.

Por ahora, hacemos una pausa.  Si desea más información o asesoría personalizada sobre este tema, una empresa de consultoría que forma parte de la organización de la que el que esto escribe presta sus sus servicios profesionales, escriba a luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le enlazaremos,

Referencias para consulta:
http://saberalimentario.aibonline.org/saber-alimentario/2017/8/22/gua-general

http://foodsafety.merieuxnutrisciences.com/2018/01/09/technical-tuesday-beyond-filing-environmental-monitoring-results/

https://img04.en25.com/Web/MerieuxNutrisciencesCorporation/%7B88e5bf74-1ffb-4a49-9f8b-97513f2420e7%7D_Swabathon_Webinar_August_2017.pdf

Cómo funciona un ensayo de sustrato cromogénico para análisis microbiológico

Principios y Fundamento del funcionamiento de los ensayos de sustrato cromogénico en Microbiología

Continuando con esta serie de colaboraciones semanales, abordaremos ahora un interesante tema de una tecnología que se ha vuelto bastante reconocida y popular en este siglo y que fue desarrollada hacia finales de los años 70, es decir, alrededor de 40 años atrás (se escribe esta entrada el 23 de Enero de 2018).

¿Qué es la tecnología, cómo funciona y para qué sirve?

El nombre de la Tecnología nos dá una idea general de la misma:  Tecnología de Sustrato Cromogénico.  Es una técnica analítica usada en Microbiología para detección, identificación y cuantificación de diferentes microorganismos de interés para el ser humano, incluyendo bacterias indicadoras como los mesófilos aerobios, los coliformes totales, los hongos y levaduras así como otras de naturaleza patógena para humanos y animales incluyendo gérmenes como Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, bacterias E.coli TOP STEC, Cronobacter sakazakii,  Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus y muchas más.

La manera en la que funciona esta tecnología incluye un sustrato con propiedades cromogénicas.  Este sustrato suele ser una molécula con 2 componentes: Un compuesto enlazado a una fracción que al desprenderse en una solución, desarrolla color (El complejo cromogénico es incoloro cuando está completo; cuando se separa en 2, una de las secciones es una molécula cromógena o formadora de un color específico que puede ser rojo malva, azulado, verde, amarillo, rojo intenso, café y una variedad de colores adicionales).

Funciona para detección de bacterias, hongos y levaduras porque aprovecha que cada microorganismo ó grupo de estos tiene enzimas metabólicas que son propias del género, del grupo o de la especie.  Algunas de estas enzimas pueden metabolizar ciertos sustratos incoloros y cuando liberan el cromógeno, la solución ó la colonia (si estuviere en una placa de agar) precipitan y desarrollan una coloración altamente característica.

Un ejemplo clásico es un sustrato conocido como CPRG ó Rojo de Fenilo Beta-D-Galactopiranósido) y el CPRG-MUG (Rojo de Fenil Umbeliferil Beta-D-Glucurónido).

Este se usa para detectar coliformes totales y E.coli (las 2 en uno).  Las coliformes totales tienen la enzima Beta-D-Galactosidasa que metaboliza el CPRG (en solución es amarillo) y cuando eso ocurre, el rojo de fenil ligado se convierte en rojo de fenilo que precipita de un color rojo característico ó tiñe la solución si fuera en una muestra de agua.    De manera simultánea, si existe E.coli dentro de la misma muestra,  esta última tiene la enzima Beta-D-Glucoronidasa, que metaboliza el CPRG-MUG y desprende la metil umbeliferona, que es una molécula fluorogénica (produce fluorescencia visible bajo luz ultravioleta de 350 a 365 nanómetros de longitud de onda).

Esta tecnología se ha usado en diferentes ensayos rápidos o complementarios para identificación, detección y cuantificación bioquímica de diferentes bacterias, hongos y levaduras.  

Sus ventajas más importantes incluyen:

* Facilidad para la interpretación

* Costos sumamente competitivos

* Incrementa de manera considerable la especificidad

* Disminuye la necesidad de buscar colonias por morfología

* No depende de colorantes que tienen diferentes matices por el pH del medio o la muestra

* Permite el uso de múltiples sustratos en una placa de agar para detección de diferentes microorganismos como parte de una muestra, simplificando el tiempo, recurso económico y esfuerzo para la detección y/o identificación del germen buscado

* Hoy por hoy es una tecnología que ha sido validada prácticamente por 4 décadas

Existen diferentes empresas de renombre mundial que la han incorporado tanto a formulaciones de agar como a formulaciones líquidas que se pueden usar para contabilización de bacterias y/o  para formatos de Número Más Probable ó de Presencia-Ausencia de microorganismo.

Si desea información adicional de cómo puede usted beneficiarse de esta tecnología en su empresa o laboratorio, mándenos un correo-e ó un mensaje escrito al celular (52)8119990225 y con gusto le canalizamos con quien le pueda ayudar y mostrarle en vivo y a todo color cómo puede usted obtener dichos beneficios.

Por ahora hacemos una pausa...

Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Cuando una empresa decide adoptar la posibilidad de realizar un ensayo rápido para "screening" o tamizaje de un microorganismo patógeno, una de las opciones más populares y con mayor cantidad de opciones en el mercado a nivel internacional, es la Tecnología de Flujo Lateral (o Lateral Flow Device = LFD por las siglas en inglés).

¿Qué son estas pruebas y cómo funcionan o cuál es el fundamento?

La explicación más simple para personas adultas no expertas en temas de microbiología, que alguna vez fueron o hayan sido padres de familia, son las pruebas de embarazo rápido que se pueden comprar en cualquier farmacia.  En estas pruebas, se detecta una hormona en muestras de orina, específicamente la GCH Gonadotropina Coriónica Humana, la cual es producida por el embrión como un mecanismo de defensa para evitar ser expulsado del útero materno y que pueda implantarse en la placenta.

El mecanismo con el que esta hormona es detectado es exactamente el mismo principio que se usa en la mayoría de las pruebas de flujo lateral.

Los componentes de ensayo incluyen:

1) Base o Tira de Celulosa por la que corre el ensayo.

2) Set de antígenos marcados con oro coloidal específicos para el contaminante a buscar.

3) Set de antígenos de control marcados con oro coloidal que sirven como control interno y de calidad para verificar que el ensayo funcionó exitosamente.

A continuación, colocamos una secuencia de imágenes de los pasos que ocurren durante el ensayo:

1) A la tableta ó tira, se le añaden normalmente de 100 a 200 microlitros de la solución donde se pre-enriqueció la muestra en la que estamos buscando el patógeno o contaminante.  Si es un dispositivo tipo tableta, tiene un pequeño orificio donde se inocula dicha muestra.  Si es una tira simple, normalmente se inserta en un tubo con la muestra para que el flujo corra hacia arriba en la membrana de celulosa.

2) Como es una prueba inmunológica Antígeno-Anticuerpo, ambas moléculas son proteínas que funcionan como una llave-cerradura. Es decir, son complementarias y específicamente diseñadas a  nivel biológico para acoplarse mutuamente.  En la membrana de celulosa, se "carga" o embebe un complejo de oro coloidal con antígenos específicos para los anticuerpos de la bacteria o contaminante deseado y otro bloque que servirá como control de calidad.  El fluido arrastra este complejo de izquierda a derecha ó de abajo hacia arriba, para ir generando la reacción deseada.

3) Este complejo arrastrado, al pasar por la sección para detectar si están presentes los anticuerpos deseados, genera una precipitación del oro coloidal al generarse una especie de sandwich en la que el anticuerpo de la bacteria que se había unido a los antígenos del complejo de oro coloidal, precipita o completa un bloque de antígeno-anticuerpo-antígeno que se denota como una línea de color rojo (por el oro coloidal).

4) La prueba se completa cuando el complejo de oro coloidal inicial termina y embebe la parte final de la membrana de celulosa, en la que se cargaron anticuerpos complementarios de control para que precipiten con los antígenos de control iniciales. Esta reacción permite detectar que la muestra corrió hasta el final y que se están dando reacciones antígeno-anticuerpo precipitadas con oro coloidal, independientemente si hubo o no anticuerpos del germen o contaminante deseado, que precipitarían en la primera línea ó de prueba/muestra.

Una manera muy coloquial para explicar lo anterior, es equiparar al complejo precipitado como un sandwich de jamón simple.  En esta analogía, la tapa superior del pan es el complejo de antígeno bañado con oro coloidal y la tapa inferior del pan es el complemento para que precipite.  Lo que completaría este sandwich, sería la rebanada de jamón.  En este caso, los anticuerpos de la bacteria ó contaminante buscados serían el equivalente a esa rebanada de jamón. Cuando el sandwich se completa, es como si las tapas estuvieran impregnadas de salsa de tomate y cambian de color blanco al rojo de dicha salsa de tomate.

Los ensayos de flujo lateral tienen más de 50 años en el mercado, pero su uso se ha vuelto extremadamente popular para aplicaciones en microbiología de alimentos y sanitaria en los últimos 25 años.

Ventajas que tienen:

1) Simpleza para llevarse a cabo

2) Fáciles de implementar en empresas/laboratorios de cualquier tamaño

3) Las puede realizar casi cualquier persona

4) Lectura muy sencilla

5) Si los componentes de los antígenos son de alta calidad, son MUY precisas y confiables

6) Suelen ser económicas

7) Tienen incorporado un control interno que permite saber si funcionaron o no

8) En el caso de la detección de bacterias patógenas, requieren normalmente de una concentración entre 100,000 y 1,000,000 (1x10 a la 5 ó 1x10 a la 6) células viables para que se forme una reacción colorida claramente visible.  En concentraciones menores de 1000 hasta 10,000 no se forman lineas suficientemente claras y tendrían a dar resultados falsamente negativos.

Por ahora, hacemos un pausa.  Si usted desea conocer más sobre la implementación de uno de estos ensayos para detección de Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 ó algún otro contaminante, escríbanos a luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le podemos remitir con quien pueda asesorarle directamente en su lugar de origen o trabajo.

Criterios de Selección para un equipo de PCR ó Biología Molecular para Análisis de Alimentos

En nuestro diario contacto con empresas de alimentos, mucha gente nos pregunta cuáles son o debieran ser los criterios para la selección de un equipo de PCR para análisis de alimentos; considerando que es una tecnología que todavía es de alto costo de inversión inicial.

Desarrollamos un cuestionario que puede serle útil para diferenciar entre cualquier opción de mercado que usted llegue a seleccionar y que si está en proceso de búsqueda, las considere para una toma de decisiones más informada.

Lo que debe preguntar/indagar es:
1) ¿Qué es lo que usted como usuario entiende por un método molecular?
2) ¿Cuál es la diferencia entre un método molecular ó un método de PCR?
3) ¿Qué gobierno en el mundo con una autoridad sanitaria reconocida como USDA-FDA (EEUU) ó Health Canada ó Nueva Zelanda ó Australia ó algún país de la CEE está empleando YA el equipo que está considerando comprar/evaluar?
4) ¿Qué es lo más importante para ud. cuando hace un monitoreo de patógenos por PCR?
5) ¿Qué tanta grasa tienen las matrices de los productos que analizará por PCR?
6) ¿Qué tanta clorofila tienen las matrices de los productos que analizará por PCR?
7) ¿Qué tantos compuestos antioxidantes tienen las matrices de los productos que analizará por PCR?
8) ¿Alguna de sus matrices incluye especias como paprika, cebollo, ajo, pimienta, laurel, comino o alguna otra? Todas son inhibidoras conocidas de la reacción de PCR.
9) ¿Qué tan frecuente las matrices que llegue a analizar por PCR tienen o tendrían presencia de coliformes totales?
10) ¿Qué tan frecuente las matrices que llegue a analizar por PCR tienen o tendrían presencia de bacterias como Proteus, Citrobacter ó E.coli?
11) ¿Cuánta muestra efectiva desea inocular en los tubos de amplificación en los tubos de PCR?
12) ¿Cómo puede asegurar en el método de PCR/Molecular que un negativo es realmente un negativo y que tenga documentación que ampare esta situación?
13) ¿Qué nivel de sensibilidad tiene el método de PCR que esté considerando?
14) ¿Qué estudio(s) tiene el proveedor(es) de ese método que avale la sensibilidad?
15) ¿Qué porcentaje de falsos positivos tiene el método de PCR que esté considerando?
16) ¿Qué porcentaje de falsos negativos tiene el método de PCR que esté considerando?
17) ¿Qué empresas de las 10 más reconocidas en el mundo del área de alimentos ya están usando el método de PCR que desea considerar/evaluar?
18) ¿Qué mantenimiento necesita el equipo de PCR que desea considerar/evaluar?
19) ¿Qué soporte local le puede ofrecer la empresa que distribuye o vende la tecnología de PCR?
20) ¿Qué tan importante es un TTR (Tiempo Total de Resultados) para bacterias como Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7 ó E.coli -STEC Big Six sea menor a 1 día ó de 8 a 12 horas?
21) ¿Cuántas matrices consideró para la validación  de los diferentes patógenos como Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, E.coli-STEC Big Six u otras tiene el método de PCR?
22) ¿Incluye o tiene algún sistema para purificar la muestra antes de procesarla?  Se ha ido expandiendo el uso de la IMS u otras tecnologías para purificar y concentrar la muestra en los últimos 5 a 10 años.
23) ¿Qué nivel de concentración Log requiere en sus matrices tras el pre-enriquecimiento para que pueda ser detectada por el sistema de reactivos y equipo de PCR en evaluación?
24) ¿Cuál es el tiempo de caducidad de los kits que maneja el proveedor de PCR?
25) ¿Cómo se calibra el termociclador que tiene el proveedor de PCR?
26) ¿Qué interferencias conocidas sabe el proveedor que tiene la tecnología que le esté ofreciendo?
27) ¿Tiene ya alguna validación para los kits que maneje el equipo tales como AOAC-OMA ó MicroVal ó AFNOR o similares?
28) ¿Cuántas muestras puede correr por día?
29) ¿El equipo es escalable? ¿Tiene opciones para hacerlo crecer en # de análisis?
30) ¿El equipo de PCR tiene capacidades Multiplex?
31) ¿El equipo de PCR puede correr muestras simultáneas de diferentes patógenos?
32) ¿El equipo de PCR produce señales de indeterminados, no amplificados ó alguna otra que requiera que las muestras se tengan que repetir?
33) ¿Qué tipo de sondas utiliza el equipo de PCR para la detección del patógeno buscado?
34) ¿Qué tan robusto es el equipo para uso rudo o de muchas muestras?
35) ¿Qué tipo de sistema de enfriamiento y calentamiento utiliza?

Estas son algunos de los cuestionamientos más representativos que le pueden ser de utilidad para evaluar una metodología de PCR para análisis de patógenos.

Esperemos que le puedan ser de utilidad.

Por ahora, hacemos una pausa.