Monitoreo ambiental en su Planta. ¿Qué hago ahora con los resultados?

"Qué hacer con  sus resultados de monitoreo ambiental de patógenos e indicadores"

La presente información que me permito compartir en esta entrada, surgió como una motivación después de leer a un par de expertos de Merieux Nutrisciences (Jeniffer Johson, Consultora Técnica y  Tim Freier, Vicepresidente de la División de Ciencias, Asuntos Regulatorios y Microbiología).

En una entrada reciente del mes de Enero de 2018, comentamos sobre los "Swab-a-Thons" que están llevando a cabo en los Estados Unidos de América, por parte de la FDA, para hacer mapeos de la presencia de patógenos en las plantas de alimentos (re-leer https://iso22000yhaccp.blogspot.mx/2018/01/la-importancia-del-monitoreo-de.html).

Algo que no mencionamos en dicha entrada, es que la FDA tiene la consigna de hacer secuienciación genética completa de los microorganismos encontrados, que no es otra cosa que obtener una huella identificatoria única de cada uno, al nivel de tenerlos en un archivo de "criminales más buscados" para que si llega a presentarse un delito, en este caso, un brote de enfermedad transmitida por alimentos, se pueda hacer una comparación del germen aislado vs. los registros de la base de datos que está construyendo la FDA.

Me permito compartir algunos puntos clave de cómo abordar el tema de los resultados que obtenga de su programa de análisis microbiológicos, incluyendo sus propios "Swab-a-thons" de control interno.

1) Debe realizar un mapa con el layout o la distribución geográfica de su planta en las 4 zonas de monitoreo recomendados por la FDA.

Zona 1 : Superficies de contacto directo con producto (rebanadoras, bandas, peladoras, tablas de corte, deshuese u otros procesos, utensilios, carros, mesas de trabajo).

Zona 2 :  Areas exteriores de los equipos, unidades de enfriamiento, carcazas ó contenedores, marcos, pisos).

Zona 3 :  Transportadores, cabinas, montacargas, drenajes, pisos de áreas no críticas.

Zona 4 :  Area de vestidores, pasillos, áreas de reunión, cafetería.

2) La información del mapa previo, es conveniente superponerla con patrones de tráfico de personal, movimiento o flujo del proceso de producción, ubicación de los drenajes, ubicación de las tuberías, etc.  de manera que pueda hacer un cruce informativo de causas y efectos, en relación al monitoreo de microorganismos indicadores, pero especialmente de patógenos.

3) Evaluar patrones de presencia y acumulación de humedad, especialmente en las zonas 1 y 2.  Es muy importante que considere las observaciones del personal de mantenimiento. Recuerde que la presencia de humedad suele asociarse con Listeria y lugares secos por mucho tiempo, con formación de polvo, con la de Salmonella.

4) Realice un análisis estadístico de la temporalidad con la que ha encontrado positivos. ¿Es en una época específica del año?  ¿Están ligados a un turno en particular? ¿Ocurren con más frecuencia con algún proceso donde involucre materias primas con  mayor riesgo de contaminación cruzada? ¿Se asocian con  movimientos de personal clave perteneciente al área de Sanidad, Aseguramiento de Calidad ú Operaciones?  ¿Ocurren en períodos de alta o de baja producción?

5) Finalmente, es importante que involucre a un equipo multidisciplinario para el análisis de sus conclusiones. Esto debe incluir personal de producción, calidad, mantenimiento, operaciones, laboratorio e incluso auditores externos para que le apoyen en la identificación e implementación de acciones correctivas ó preventivas con suficiente anticipación.      

El factor más importante a considerar es que si toma suficientes mediciones y análisis de monitoreo ambiental, difícilmente estará  a ciegas cuando llegare a  presentarse un problema de contaminación en producto terminado y le permitirá hacer un control de daños mucho más rápido, efectivo y eficaz que si sólo tiene unos cuantos resultados dispersos, con poca frecuencia y representatividad de la situación que viven en sus instalaciones cada mes del año.

Por ahora, hacemos una pausa.  Si desea más información o asesoría personalizada sobre este tema, una empresa de consultoría que forma parte de la organización de la que el que esto escribe presta sus sus servicios profesionales, escriba a luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le enlazaremos,

Referencias para consulta:
http://saberalimentario.aibonline.org/saber-alimentario/2017/8/22/gua-general

http://foodsafety.merieuxnutrisciences.com/2018/01/09/technical-tuesday-beyond-filing-environmental-monitoring-results/

https://img04.en25.com/Web/MerieuxNutrisciencesCorporation/%7B88e5bf74-1ffb-4a49-9f8b-97513f2420e7%7D_Swabathon_Webinar_August_2017.pdf

Cómo funciona un ensayo de sustrato cromogénico para análisis microbiológico

Principios y Fundamento del funcionamiento de los ensayos de sustrato cromogénico en Microbiología

Continuando con esta serie de colaboraciones semanales, abordaremos ahora un interesante tema de una tecnología que se ha vuelto bastante reconocida y popular en este siglo y que fue desarrollada hacia finales de los años 70, es decir, alrededor de 40 años atrás (se escribe esta entrada el 23 de Enero de 2018).

¿Qué es la tecnología, cómo funciona y para qué sirve?

El nombre de la Tecnología nos dá una idea general de la misma:  Tecnología de Sustrato Cromogénico.  Es una técnica analítica usada en Microbiología para detección, identificación y cuantificación de diferentes microorganismos de interés para el ser humano, incluyendo bacterias indicadoras como los mesófilos aerobios, los coliformes totales, los hongos y levaduras así como otras de naturaleza patógena para humanos y animales incluyendo gérmenes como Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, bacterias E.coli TOP STEC, Cronobacter sakazakii,  Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus y muchas más.

La manera en la que funciona esta tecnología incluye un sustrato con propiedades cromogénicas.  Este sustrato suele ser una molécula con 2 componentes: Un compuesto enlazado a una fracción que al desprenderse en una solución, desarrolla color (El complejo cromogénico es incoloro cuando está completo; cuando se separa en 2, una de las secciones es una molécula cromógena o formadora de un color específico que puede ser rojo malva, azulado, verde, amarillo, rojo intenso, café y una variedad de colores adicionales).

Funciona para detección de bacterias, hongos y levaduras porque aprovecha que cada microorganismo ó grupo de estos tiene enzimas metabólicas que son propias del género, del grupo o de la especie.  Algunas de estas enzimas pueden metabolizar ciertos sustratos incoloros y cuando liberan el cromógeno, la solución ó la colonia (si estuviere en una placa de agar) precipitan y desarrollan una coloración altamente característica.

Un ejemplo clásico es un sustrato conocido como CPRG ó Rojo de Fenilo Beta-D-Galactopiranósido) y el CPRG-MUG (Rojo de Fenil Umbeliferil Beta-D-Glucurónido).

Este se usa para detectar coliformes totales y E.coli (las 2 en uno).  Las coliformes totales tienen la enzima Beta-D-Galactosidasa que metaboliza el CPRG (en solución es amarillo) y cuando eso ocurre, el rojo de fenil ligado se convierte en rojo de fenilo que precipita de un color rojo característico ó tiñe la solución si fuera en una muestra de agua.    De manera simultánea, si existe E.coli dentro de la misma muestra,  esta última tiene la enzima Beta-D-Glucoronidasa, que metaboliza el CPRG-MUG y desprende la metil umbeliferona, que es una molécula fluorogénica (produce fluorescencia visible bajo luz ultravioleta de 350 a 365 nanómetros de longitud de onda).

Esta tecnología se ha usado en diferentes ensayos rápidos o complementarios para identificación, detección y cuantificación bioquímica de diferentes bacterias, hongos y levaduras.  

Sus ventajas más importantes incluyen:

* Facilidad para la interpretación

* Costos sumamente competitivos

* Incrementa de manera considerable la especificidad

* Disminuye la necesidad de buscar colonias por morfología

* No depende de colorantes que tienen diferentes matices por el pH del medio o la muestra

* Permite el uso de múltiples sustratos en una placa de agar para detección de diferentes microorganismos como parte de una muestra, simplificando el tiempo, recurso económico y esfuerzo para la detección y/o identificación del germen buscado

* Hoy por hoy es una tecnología que ha sido validada prácticamente por 4 décadas

Existen diferentes empresas de renombre mundial que la han incorporado tanto a formulaciones de agar como a formulaciones líquidas que se pueden usar para contabilización de bacterias y/o  para formatos de Número Más Probable ó de Presencia-Ausencia de microorganismo.

Si desea información adicional de cómo puede usted beneficiarse de esta tecnología en su empresa o laboratorio, mándenos un correo-e ó un mensaje escrito al celular (52)8119990225 y con gusto le canalizamos con quien le pueda ayudar y mostrarle en vivo y a todo color cómo puede usted obtener dichos beneficios.

Por ahora hacemos una pausa...

Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Cuando una empresa decide adoptar la posibilidad de realizar un ensayo rápido para "screening" o tamizaje de un microorganismo patógeno, una de las opciones más populares y con mayor cantidad de opciones en el mercado a nivel internacional, es la Tecnología de Flujo Lateral (o Lateral Flow Device = LFD por las siglas en inglés).

¿Qué son estas pruebas y cómo funcionan o cuál es el fundamento?

La explicación más simple para personas adultas no expertas en temas de microbiología, que alguna vez fueron o hayan sido padres de familia, son las pruebas de embarazo rápido que se pueden comprar en cualquier farmacia.  En estas pruebas, se detecta una hormona en muestras de orina, específicamente la GCH Gonadotropina Coriónica Humana, la cual es producida por el embrión como un mecanismo de defensa para evitar ser expulsado del útero materno y que pueda implantarse en la placenta.

El mecanismo con el que esta hormona es detectado es exactamente el mismo principio que se usa en la mayoría de las pruebas de flujo lateral.

Los componentes de ensayo incluyen:

1) Base o Tira de Celulosa por la que corre el ensayo.

2) Set de antígenos marcados con oro coloidal específicos para el contaminante a buscar.

3) Set de antígenos de control marcados con oro coloidal que sirven como control interno y de calidad para verificar que el ensayo funcionó exitosamente.

A continuación, colocamos una secuencia de imágenes de los pasos que ocurren durante el ensayo:

1) A la tableta ó tira, se le añaden normalmente de 100 a 200 microlitros de la solución donde se pre-enriqueció la muestra en la que estamos buscando el patógeno o contaminante.  Si es un dispositivo tipo tableta, tiene un pequeño orificio donde se inocula dicha muestra.  Si es una tira simple, normalmente se inserta en un tubo con la muestra para que el flujo corra hacia arriba en la membrana de celulosa.

2) Como es una prueba inmunológica Antígeno-Anticuerpo, ambas moléculas son proteínas que funcionan como una llave-cerradura. Es decir, son complementarias y específicamente diseñadas a  nivel biológico para acoplarse mutuamente.  En la membrana de celulosa, se "carga" o embebe un complejo de oro coloidal con antígenos específicos para los anticuerpos de la bacteria o contaminante deseado y otro bloque que servirá como control de calidad.  El fluido arrastra este complejo de izquierda a derecha ó de abajo hacia arriba, para ir generando la reacción deseada.

3) Este complejo arrastrado, al pasar por la sección para detectar si están presentes los anticuerpos deseados, genera una precipitación del oro coloidal al generarse una especie de sandwich en la que el anticuerpo de la bacteria que se había unido a los antígenos del complejo de oro coloidal, precipita o completa un bloque de antígeno-anticuerpo-antígeno que se denota como una línea de color rojo (por el oro coloidal).

4) La prueba se completa cuando el complejo de oro coloidal inicial termina y embebe la parte final de la membrana de celulosa, en la que se cargaron anticuerpos complementarios de control para que precipiten con los antígenos de control iniciales. Esta reacción permite detectar que la muestra corrió hasta el final y que se están dando reacciones antígeno-anticuerpo precipitadas con oro coloidal, independientemente si hubo o no anticuerpos del germen o contaminante deseado, que precipitarían en la primera línea ó de prueba/muestra.

Una manera muy coloquial para explicar lo anterior, es equiparar al complejo precipitado como un sandwich de jamón simple.  En esta analogía, la tapa superior del pan es el complejo de antígeno bañado con oro coloidal y la tapa inferior del pan es el complemento para que precipite.  Lo que completaría este sandwich, sería la rebanada de jamón.  En este caso, los anticuerpos de la bacteria ó contaminante buscados serían el equivalente a esa rebanada de jamón. Cuando el sandwich se completa, es como si las tapas estuvieran impregnadas de salsa de tomate y cambian de color blanco al rojo de dicha salsa de tomate.

Los ensayos de flujo lateral tienen más de 50 años en el mercado, pero su uso se ha vuelto extremadamente popular para aplicaciones en microbiología de alimentos y sanitaria en los últimos 25 años.

Ventajas que tienen:

1) Simpleza para llevarse a cabo

2) Fáciles de implementar en empresas/laboratorios de cualquier tamaño

3) Las puede realizar casi cualquier persona

4) Lectura muy sencilla

5) Si los componentes de los antígenos son de alta calidad, son MUY precisas y confiables

6) Suelen ser económicas

7) Tienen incorporado un control interno que permite saber si funcionaron o no

8) En el caso de la detección de bacterias patógenas, requieren normalmente de una concentración entre 100,000 y 1,000,000 (1x10 a la 5 ó 1x10 a la 6) células viables para que se forme una reacción colorida claramente visible.  En concentraciones menores de 1000 hasta 10,000 no se forman lineas suficientemente claras y tendrían a dar resultados falsamente negativos.

Por ahora, hacemos un pausa.  Si usted desea conocer más sobre la implementación de uno de estos ensayos para detección de Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 ó algún otro contaminante, escríbanos a luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le podemos remitir con quien pueda asesorarle directamente en su lugar de origen o trabajo.

Implicaciones de problemas de Seguridad en Alimentos para Productores de Frutas y Hortalizas

Revisando la información de lo que ha ocurrido en los últimos meses y el inicio en este mes de uno de los juicios más importantes que han ocurrido en los Estados Unidos, ligados a muertes por un Brote de Listeriosis, en el que los hermanos y propietarios de la Granja Jensen Farms de Colorado, han sido acusados de negligencia criminal por permitir la introducción de alimentos adulterados, causantes de más de 30 muertes, al sistema de alimentos interestatal de su país, nos lleva a hacer una profunda reflexión sobre las implicaciones de este evento.

En realidad, la producción de alimentos seguros a nivel primario, no es tan complicado siempre y cuando se sigan los principios básicos de limpieza, desinfección y saneamiento y se lleve a cabo un estricto control de las Buenas Prácticas Agrícolas en lo general.

Hay un dicho mexicano que dice "El diablo está en los detalles" y es precisamente en los pequeños detalles, donde se generan los grandes problemas de la Inocuidad y la Seguridad Alimentaria.

Ejemplos:
1) Lavado inadecuado y con insuficiente frecuencia de las manos.
2) No poner suficiente atención en las concentraciones de jabones y sanitizantes para el proceso de POES.
3) Hacer monitoreos de limpieza o de contaminación microbiológica en producto terminado, agua o equipos solo un par de veces al mes o al semestre o al año, en un intento mal entendido de ahorrar recursos.
4) No capacitar una y otra vez a los empleados del empaque en las BPA ó en proceso de inocuidad.
5) Insuficiente control de plagas o fauna nociva en el empaque o sus alrededores.

Podría seguir mencionando inumerables ejemplos, pero el punto que deseo ilustrar en esta pequeña colaboración es muy simple:
Cualquier inversión de tiempo y recursos financieros enfocados a la mejora continua de condiciones sanitarias, higiénicas y de seguridad alimentaria, se acaban pagando al 1000 x 1.

Dejo un enlace de Jack In The Box, que aprendieron la lección de la manera más dura.

http://www.foodsafetymagazine.com/magazine-archive1/junejuly-2007/jack-in-the-box-fostering-food-safety-through-great-partnering/

http://www.jackintheboxinc.com/responsibility/food-safety

Seguiremos comentando y recordemos....

1) Bastan 10 colonias de E.coliO157:H7 por gramo de alimento para enfermar a un niño o anciano.
2) Bastan menos de 300 colonias de Listeria monocytogenes por gramo de alimento para generar un brote alimentario.
3) Bastan alrededor de 1000 células vegetativas de Salmonella para producir la fiebre tifoidea.

Análisis de Salmonella en 12 horas (siempre buscado, finalmente alcanzado)

Después de una enorme pausa en actualizar el presente blog, ahora comparto una noticia realmente de avanzada para el campo de la microbiología de alimentos: El monitoreo de la bacteria Salmonella en tan sólo 12 horas para Tiempo Total de Resultados (un auténtico análisis o método rápido).

El método tradicional, que sigue existiendo y está referenciado en la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS, próxima a ser reemplazada por el PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-210-SSA1-2013, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y toxinas microbianas, sigue requiriendo el largo, tedioso y complicado proceso de aislamiento del patógeno Salmonella,  con los mismos pasos de siempre:
1) Pre-enriquecimiento x 24 horas
2) Enriquecimiento selectivo x 24 horas adicionales
3) Aislamiento selectivo en agar diferencial x 24 horas adicionales
4) Pruebas bioquímicas presuntivas x 24-48 horas adicionales
5) Pruebas bioquímicas confirmativas x 24-72 horas adicionales
6) Puebas de identificación serológica x 24-72 horas adicionales

Tiempo total de resultados: 7 a 9 días.

Si para el procesador actual, un día es mucho tiempo, imaginémonos cuánto son al menos 4 a 5 días para estar seguros que realmente no es una bacteria Salmonella, la que está en nuestro producto o en las superficies de nuestras instalaciones.

Por muchos años, la comunidad científica y las empresas especializadas en ensayos rápidos, especialmente aquellas enfocadas a Biología Molecular y más específicamente, las que han desarrollados kits o ensayos del método conocido como Reacción En Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction, por las siglas en inglés), las que han estado buscando reducir el tiempo de análisis durante la última década.

 Existen varias compañías en el mercado que ya tienen kits de PCR para Salmonella, pero el tiempo más rápido logrado hasta ahora con reconocimiento oficial es de 20 horas (por la cía. Biocontrol Systems con su Assurance GDS para Salmonella).  La empresa que inició y popularizó la tecnología de PCR para el sector industrial de alimentos y laboratorios de pruebas, DUPONT Qualicon, con la tecnología BAX, tiene kits que demoran entre 24 y 30 horas, según el protocolo de enriquecimiento acorde a la matriz alimentaria utilizada y ha desarrollado un kit de PCR de tiempo real en menor tiempo que está en proceso de pruebas y futura liberación, posiblemente dentro del siguiente año calendario.

En el caso específico de esta entrada del Blog, me quiero referir a la Tecnología Assurance GDS para Salmonella (que dicho sea de paso, la empresa para la que presto mis servicios profesionales, es distribuidor autorizado para la República Mexicana) en un plan 100% técnico y que sean los lectores y usuarios finales quienes vean si esta tecnología les puede o no ayudar para sus planes de monitoreo microbiológico; sin embargo, para que un ensayo de Salmonella se pueda considerar realmente como un ensayo, método, metodología o prueba rápida, el estándar a vencer al momento presente son 24 horas o menos.

Lo que incluye la tecnología es:
* Sistema de reactivos con control interno, sonda, primers y Enzima Polimerasa incluida
* Tiempo de preparación con proceso acoplado de InmunoSeparación Magnética (IMS)
* Equipo de PCR desarrollado por Qiagen, Rotor-Q, que cuenta con opción para corridas de 36 o hasta de 72 ensayos por corrida.  Comercialmente, el equipo se vende como Termociclador Assurance GDS, de plataforma cerrada para los ensayos desarrollados por Biocontrol Systems.
* Protocolo de enriquecimiento acorde al Manual de Bacteriología Analítica, basado en Agua Peptonada Bufferada de 18 a 22 horas totales, universal para más del 99% de las muestras, excepto en leche descremada en polvo o similares que requieren Agua Verde Brillante.
* Protocolo de enriquecimiento recién liberado por Biocontrol y en vías de ser considerado como una Modificación Menor en el proceso, de manera que la tecnología seguiría conservando su estatus como AOAC Official Method of Analysis 2009.03, usando un medio propietario mEHEC, que también es usado para pruebas de E.coliO157:H7 y las TopSTEC (Big Six); en sólo 8 a 10 horas.
* Tiempo total de resultados con APB:  20 horas mínimo.
* TIEMPO TOTAL DE RESULTADOS CON mEHEC:  10 a 12 horas

¿Cómo ha logrado reducir tanto los tiempos desde 7-9 días a tan sólo medio día?

•  Usando el proceso de IMS que concentra la muestra en tan sólo 20 minutos y que limpia la muestra de microorganismos que interfieren o causan reacción cruzada en el aislamiento diferencial

•  Usando la sensibilidad-nivel de detección típica de un buen termociclador de sólo 1000 a 10,000 células vegetativas, en vez del 1,000,000 a 10,000,000 que requiere el método tradicional o métodos inmunológicos rápidos de ELISA, flujo lateral, ELFA, etc.

• Utilizando la Sonda MGBH Eclipse que incrementa exponencialmente los resultados y la precisión para la detección de los fragmentos del ADN que se reproducen duranta la reacción propia de PCR

• Utilizando un  medio enriquecido con suplementos especiales que ayudan al rápido desarrollo de los microorganismos objetivo de manera altamente selectiva.

Para cualquier lector interesado en saber más detalles, puede consultar los siguientes vínculos:

http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs

http://www.biocontrolsys.com/products/view/salmonela
http://www.biocontrolsys.com/news/view/new-8-hour-enrichment-for-assurance-gds

Seguiremos informando.
 

Uso de indicadores alternativos para Salmonella

La bacteria Salmonella que es un bacilo gram negativo, no esporulado y con más del 99% de sus serotipos altamente móviles (por ser flagelada)forma parte del Género de las enterobacterias, conocido en latin como Enterobacteriaceae.

Se pueden encontrar datos adicionales en: http://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae.

Una de las mayores dificultades para aislar a este microorganismo patógeno y para poderlo aislar de diferentes alimentos y/o en el medio ambiente de las plantas de producción, es que requiere una serie de medios de cultivo especiales para su desarrollo y suele ser inhibido o desplazado por el crecimiento de otras bacterias con mayor tasa de duplicación como la E.coli, Proteus o las bacterias de la familia Citrobacter.

Por ende, su aislamiento es muy largo y complicado. En un documento que desarrollamos para promoción de algunas pruebas rápidas que manejamos en la empresa para la que presto mis servicios: http://bit.ly/Analisis-Salmonella, se puede observar muy claramente que demora hasta 9 días acorde a la Norma Oficial Mexicana o acorde al Manual de Bacteriología Analítica de los Estados Unidos (BAM).

Por ende, una alternativa que puede funcionar para aquellas empresas que no puedan o tengan complicaciones especiales para poder analizar Salmonella, incluso aunque usan una tecnología rápida de 28 a 48 horas, el monitoreo y recuento de gérmenes de la familia Enterobacteriaceae, sería una de las opciones como "Screening" o monitoreo previo y que funciona de manera análoga a la búsqueda de E.coli como indicador auténtico de fecalismo, como indicador a su vez de riesgo o ausencia de V.cholerae en muestras de aguas o efluentes comerciales, industriales o naturales.

Analizar Enterobacterias es relativamente rápido, fácil, sencillo y mucho más económico que buscar Salmonella. El costo relativo entre ambos análisis oscila desde 2.5 a 3.5 USD por monitoreo para Enterobacterias vs. 9 a 17 USD por ensayo para detección de Salmonella, hasta pruebas bioquímicas presuntivas en la mayor parte de los casos.

Se puede usar el método tradicional o existen alternativas manejadas por compañías altamente reconocidas en el mercado mundial como Biocontrol Systems y 3M Food Safety.

Hacemos una pausa y continuaremos en otro momento ahondando sobre el tema

Tecnología de PCR para detección de patógenos

Después de una pequeña pausa, empezaremos a comentar con una frecuencia al menos semanal, de los tópicos que nos llevaron a crear este blog.

El tema de hoy es La Tecnología de PCR para detección de patógenos.

Desde los primeros tiempos en que empezaba la microbiología como la conocemos hoy, hacia finales del siglo XIX, con las investigaciones del Dr. Pasteur, el Dr. Koch, Samuel Petri, el Dr. Salmon y muchos renombrados individuos que pueden ser considerados como los iniciadores y que dejaron su huella para la posteridad, el ser humano se ha visto en la creciente necesidad de buscar encontrar, detectar y monitorear los seres biológicos invisibles que hoy en día conocemos a nivel genérico como microorganismos o microbios.

Este fascinante mundo, que en términos reales fueron los que primeros seres vivos que existieron sobre la Tierra (por ser la mayoría de ellos seres vivos unicelulares ó conformados por una sola célular) sigue siendo tema de estudio permanente desde esos tiempos y afortunadamente para la raza humana, se han seguido mejorando notablemente las diferentes metodologías de análisis para poder dictaminar su existencia hasta género y especie.

Hablando en términos específicos para monitoreo de microorganismos patógenos, como los que hemos hablado en temas anteriores, específicamente para tres de los microorganismos que más enfermedades causan en el ser humano y que son transmitidos mayoritariamente por consumo o ingesta de alimentos contaminados, a saber: Salmonella, Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7 (EHEC) existen tres grandes grupos de pruebas para detectarlos:

1) Microbiología tradicional en agares, caldos y serología.

2) Detección inmunológica rápida por anticuerpos en varios formatos:
Formatos de ELISA
Formatos de Inmunoprecipitación en Látex
Formatos de Inmunodifusión
Formatos de Inmunocaptura Magnética

3) Detección mediante Análisis del Material Genético de los microbios usando la tecnología de PCR (Polimerase Chain Reaction) ó de Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés.

En esta entrega del blog, comentaremos con cierto detalle qué es el PCR.

En términos muy entendibles, recordemos que todos los seres vivos y los virus (que no se consideran a nivel biológico como seres "vivos" en toda la extensión de la palabra, pero que son entes biológicos o seres que tienen características especiales) están constituidos de varios sistemas que mantienen las células que los conforman. En todos los casos, la estructura biológica por excelencia encargada de darle la "forma" a cada ser vivo, es el Acido Desoxirribonucleico o ADN (DNA en inglés). Este componente, se encuentra en los cromosomas de cada ser vivo y en el núcleo de cada microorganismo.

El ADN, es 100% único para cada ser vivo. Al ser formado por una cadena de 4 moléculas llamadas nucleótidos con sus respectivos pares complementarios y que forma una cadena o doble hélice con tramos tan cortos como 100 pares hasta varios millones, como en algunos genes humanos, existen trillones de combinaciones en esa cadena. Por la misma razón, pueden existir trillones de individuos con características totalmente distintas entre sí.

La tecnología de PCR ha tomado ventaja de esa peculiaridad del ADN y por medio del aislamiento de una parte o sección de la cadena de doble hélice, mediante un dispositivo biológico llamado Sonda y con la ayuda de una enzima especial conocida como TAQ POLIMERASA, cuya función es crear un número indeterminado de copias de fragmentos del ADN creando polímeros o copias idénticas de los los mismos, ha revolucionado por completo el mundo diagnóstico creando de facto, la disciplina que hoy llamamos Biología Molecular.

Los elementos que requiere esta tecnología son:
1) Primers
2) Sonda
3) Target u Objetivo
4) Taq Polimerasa
5) Termociclador de punto final ó de Tiempo Real
6) Sistema para detectar las copias al final (Electroforesis en gel, curvas de fusión por fluorescencia, curvas de producción de copias marcadas con fluorescencia (PCR Tiempo Real)
7) Control interno

Cada uno de los elementos cumple con una función específica:
1) Los primers es la secuencia específica de nucleótidos del ADN que son específicos del organismo que estamos tratando de detectar.

2) La sonda, que en el caso de los sistemas de Tiempo real suele ir marcada en los extremos, con un elemento conocido como Quencher (o amortiguador) y con otro que es un agente Fluorogénico o Fluoróforo. Se puede describir como una sección complementaria para los primers del microorganismo que estamos buscando detectar.

3) El target u objetivo es la secuencia simple complementaria a la que la sonda se unirá para generar su duplicación "n" veces en el ciclo que llamamos amplificación.

4) La Taq Polimerasa, es una enzima aislada del microorganismo Thermus aquaticus, encontrado en las fuentes termales de Yellowstone, Estados Unidos. Esta enzima es la responsable de generar copias o formar "polímeros" del target u objetivo, si tiene las condiciones necesarias de temperatura, acidez y oligoelementos como el cloruro de magnesio en una solución acuosa.

5) El termociclador es un dispositivo diseñado para generar de manera alterna condiciones de temperatura en rangos de 55 hasta 95°C, que permiten que la Taq Polimerasa pueda cumplir con su función de generado de copias o "amplificar" el ADN. Existen dos tipos básicos: Los de gradiente de temperatura en bloque sólido (aquí entran los de compañías como Applied Bioresearch, los de Qualicon, BioRad y otros más) y los rotativos (como el RotorGiene de Corbett Research, ahora de QIAGEN y los LightCyclers de Roche). Normalmente corren 40-50 ciclos en períodos desde 60 segundos hasta poco menos de 5 minutos; por lo cual el proceso de termociclado demora desde 45 mins hasta 3-4 horas.

6) El sistema más usado para detectar las copias generadas hasta hace poco menos de 20 años eran los sistemas de electroforesis en gel; en los últimos 10 años, surgió con más fuerza el uso de fluoróforos como el SYBR-GREEN, para poder medir la curva de fusión de los ciclos de amplificación y en los últimos 5 años, ha tomado más fuerza el uso de equipos termocicladores Tiempo Real, que usan fluoróforos altamente específicos y selectivos, que permiten incluso cuantificar concentraciones en función de las curvas de generación de la fluorescencia (en todos los casos anteriores, el termociclador tiene acoplado el sistema para detectar el SYBR-Green u otros fluoróforos; sólo para la electroforesis en gel se hace en equipos por separado).

7) El uso de controles internos se ha extendido cada vez más para demostrar, comprobar, verificar y validar al mismo tiempo que realmente ocurrió la reacción de amplificación. Estos suelen añadirse en los tubos de reacción o en los capilares que se introducen en el termociclador.

Para terminar esta descripción general sobre la Tecnología de PCR, cabe señalar que son cada vez más las empresas de todo tipo a nivel mundial y especialmente aquellas que elaboran productos sensibles a nivel microbiológico como las de alimentos congelados para consumo inmediato (RTE por las siglas en inglés), de alimentos para niños y/o fórmulas nutricionales, empresas de cárnicos procesados, empresas de productos lácteos frescos y procesadoras de alimentos orgánicos, las que han adoptado el uso comercial de esta tecnología.

Si usted está realmente interesado en alguna, busque que incluya preferentemente algun sistema de concentración de la muestra mediante un proceso como la Inmunoseparación Magnética (IMS en inglés), que es la tendencia de esta tecnología. Usar IMS acoplada con PCR Tiempo Real para buscar resultados en mucho menor tiempo de lo que tarda el método tradicional o pruebas inmunológicas como las que mencionamos anteriormente.

Actualización al Mes de Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs