Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Cuando una empresa decide adoptar la posibilidad de realizar un ensayo rápido para "screening" o tamizaje de un microorganismo patógeno, una de las opciones más populares y con mayor cantidad de opciones en el mercado a nivel internacional, es la Tecnología de Flujo Lateral (o Lateral Flow Device = LFD por las siglas en inglés).

¿Qué son estas pruebas y cómo funcionan o cuál es el fundamento?

La explicación más simple para personas adultas no expertas en temas de microbiología, que alguna vez fueron o hayan sido padres de familia, son las pruebas de embarazo rápido que se pueden comprar en cualquier farmacia.  En estas pruebas, se detecta una hormona en muestras de orina, específicamente la GCH Gonadotropina Coriónica Humana, la cual es producida por el embrión como un mecanismo de defensa para evitar ser expulsado del útero materno y que pueda implantarse en la placenta.

El mecanismo con el que esta hormona es detectado es exactamente el mismo principio que se usa en la mayoría de las pruebas de flujo lateral.

Los componentes de ensayo incluyen:

1) Base o Tira de Celulosa por la que corre el ensayo.

2) Set de antígenos marcados con oro coloidal específicos para el contaminante a buscar.

3) Set de antígenos de control marcados con oro coloidal que sirven como control interno y de calidad para verificar que el ensayo funcionó exitosamente.

A continuación, colocamos una secuencia de imágenes de los pasos que ocurren durante el ensayo:

1) A la tableta ó tira, se le añaden normalmente de 100 a 200 microlitros de la solución donde se pre-enriqueció la muestra en la que estamos buscando el patógeno o contaminante.  Si es un dispositivo tipo tableta, tiene un pequeño orificio donde se inocula dicha muestra.  Si es una tira simple, normalmente se inserta en un tubo con la muestra para que el flujo corra hacia arriba en la membrana de celulosa.

2) Como es una prueba inmunológica Antígeno-Anticuerpo, ambas moléculas son proteínas que funcionan como una llave-cerradura. Es decir, son complementarias y específicamente diseñadas a  nivel biológico para acoplarse mutuamente.  En la membrana de celulosa, se "carga" o embebe un complejo de oro coloidal con antígenos específicos para los anticuerpos de la bacteria o contaminante deseado y otro bloque que servirá como control de calidad.  El fluido arrastra este complejo de izquierda a derecha ó de abajo hacia arriba, para ir generando la reacción deseada.

3) Este complejo arrastrado, al pasar por la sección para detectar si están presentes los anticuerpos deseados, genera una precipitación del oro coloidal al generarse una especie de sandwich en la que el anticuerpo de la bacteria que se había unido a los antígenos del complejo de oro coloidal, precipita o completa un bloque de antígeno-anticuerpo-antígeno que se denota como una línea de color rojo (por el oro coloidal).

4) La prueba se completa cuando el complejo de oro coloidal inicial termina y embebe la parte final de la membrana de celulosa, en la que se cargaron anticuerpos complementarios de control para que precipiten con los antígenos de control iniciales. Esta reacción permite detectar que la muestra corrió hasta el final y que se están dando reacciones antígeno-anticuerpo precipitadas con oro coloidal, independientemente si hubo o no anticuerpos del germen o contaminante deseado, que precipitarían en la primera línea ó de prueba/muestra.

Una manera muy coloquial para explicar lo anterior, es equiparar al complejo precipitado como un sandwich de jamón simple.  En esta analogía, la tapa superior del pan es el complejo de antígeno bañado con oro coloidal y la tapa inferior del pan es el complemento para que precipite.  Lo que completaría este sandwich, sería la rebanada de jamón.  En este caso, los anticuerpos de la bacteria ó contaminante buscados serían el equivalente a esa rebanada de jamón. Cuando el sandwich se completa, es como si las tapas estuvieran impregnadas de salsa de tomate y cambian de color blanco al rojo de dicha salsa de tomate.

Los ensayos de flujo lateral tienen más de 50 años en el mercado, pero su uso se ha vuelto extremadamente popular para aplicaciones en microbiología de alimentos y sanitaria en los últimos 25 años.

Ventajas que tienen:

1) Simpleza para llevarse a cabo

2) Fáciles de implementar en empresas/laboratorios de cualquier tamaño

3) Las puede realizar casi cualquier persona

4) Lectura muy sencilla

5) Si los componentes de los antígenos son de alta calidad, son MUY precisas y confiables

6) Suelen ser económicas

7) Tienen incorporado un control interno que permite saber si funcionaron o no

8) En el caso de la detección de bacterias patógenas, requieren normalmente de una concentración entre 100,000 y 1,000,000 (1x10 a la 5 ó 1x10 a la 6) células viables para que se forme una reacción colorida claramente visible.  En concentraciones menores de 1000 hasta 10,000 no se forman lineas suficientemente claras y tendrían a dar resultados falsamente negativos.

Por ahora, hacemos un pausa.  Si usted desea conocer más sobre la implementación de uno de estos ensayos para detección de Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 ó algún otro contaminante, escríbanos a luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le podemos remitir con quien pueda asesorarle directamente en su lugar de origen o trabajo.

Implicaciones de problemas de Seguridad en Alimentos para Productores de Frutas y Hortalizas

Revisando la información de lo que ha ocurrido en los últimos meses y el inicio en este mes de uno de los juicios más importantes que han ocurrido en los Estados Unidos, ligados a muertes por un Brote de Listeriosis, en el que los hermanos y propietarios de la Granja Jensen Farms de Colorado, han sido acusados de negligencia criminal por permitir la introducción de alimentos adulterados, causantes de más de 30 muertes, al sistema de alimentos interestatal de su país, nos lleva a hacer una profunda reflexión sobre las implicaciones de este evento.

En realidad, la producción de alimentos seguros a nivel primario, no es tan complicado siempre y cuando se sigan los principios básicos de limpieza, desinfección y saneamiento y se lleve a cabo un estricto control de las Buenas Prácticas Agrícolas en lo general.

Hay un dicho mexicano que dice "El diablo está en los detalles" y es precisamente en los pequeños detalles, donde se generan los grandes problemas de la Inocuidad y la Seguridad Alimentaria.

Ejemplos:
1) Lavado inadecuado y con insuficiente frecuencia de las manos.
2) No poner suficiente atención en las concentraciones de jabones y sanitizantes para el proceso de POES.
3) Hacer monitoreos de limpieza o de contaminación microbiológica en producto terminado, agua o equipos solo un par de veces al mes o al semestre o al año, en un intento mal entendido de ahorrar recursos.
4) No capacitar una y otra vez a los empleados del empaque en las BPA ó en proceso de inocuidad.
5) Insuficiente control de plagas o fauna nociva en el empaque o sus alrededores.

Podría seguir mencionando inumerables ejemplos, pero el punto que deseo ilustrar en esta pequeña colaboración es muy simple:
Cualquier inversión de tiempo y recursos financieros enfocados a la mejora continua de condiciones sanitarias, higiénicas y de seguridad alimentaria, se acaban pagando al 1000 x 1.

Dejo un enlace de Jack In The Box, que aprendieron la lección de la manera más dura.

http://www.foodsafetymagazine.com/magazine-archive1/junejuly-2007/jack-in-the-box-fostering-food-safety-through-great-partnering/

http://www.jackintheboxinc.com/responsibility/food-safety

Seguiremos comentando y recordemos....

1) Bastan 10 colonias de E.coliO157:H7 por gramo de alimento para enfermar a un niño o anciano.
2) Bastan menos de 300 colonias de Listeria monocytogenes por gramo de alimento para generar un brote alimentario.
3) Bastan alrededor de 1000 células vegetativas de Salmonella para producir la fiebre tifoidea.

Norma N-60 para Cárnicos...Algunas observaciones importantes

A todos los procesadores de la industria cárnica que forman parte del Sistema TIF y que están homologados con los criterios del Sistema de Inspección Federal Sanitario del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (FSIS-USDA por las siglas en inglés) se les ha instruido para que ya estén aplicando el sistema o normatividad de muestreo conocido como la N60 para los monitoreos de cortes de carne cruda de res (beef trimmings) que puedan llegar a ser utilizados para convertirse eventualmente en carne molida o productos similares.

Debido a que durante los últimos 10 años, el nivel de incidencia y retiros por E.coliO157:H7 y ahora de sus parientes cercanas, las Top STEC y a los elevados costos que tiene para el sector cárnico estadounidense que genera el que sigan apareciendo estos patógenos con regularidad dentro de la cadena de suministro y que por su dosis infectiva mínima (documentada en ciertos casos desde 10 ufc/g y con un espectro de infección por debajo de 100-200 ufc/g),  los científicos encargados del Análisis de Riesgos para este sector, propusieron desde el año 2010 el cambio de las políticas de muestreo tradicionales con muestras de 25 gramos a un sistema que fuera mucho más representativo y que en volumen, pudiera tener más oportunidades de poder localizar al microorganismo objetivo y detener el producto contaminado para ser comercializado.

¿Qué ha pasado con la E.coli y las Top STEC?

Tras una larga pausa previa a esta nueva entrada, busco compartir información de relevancia sobre el estatus de las E.coliO157:H7 y las E.coli Productoras de Shigatoxinas conocidas en los Estados Unidos como las "Big Six" ó Top STEC, que traducidas al español significan E.coli Productoras de Shigatoxinas (ShigaToxin producers E.coli) 

 Las Top STEC o E.coli productoras de Shigatoxina forman parte del extenso grupo de serotipos de la esta ampliamente estudiada bacteria, que dentro de sus características más importantes es que perteneciendo a alguno de los serotipos O diferente al O157, hasta ahora tipificadas como las O26, O111, O103, O55, O145, O121 también cuentan con al menos dos genes que las pueden identificar como auténticas Top STEC, el gene de las shigatoxinas stx1, stx2 y aquél que ha sido identificada como el gen inductor de la patogenicidad para que la toxina pueda ser liberada a nivel gastrointestinal, el gen de la intimina ó eae. 

Se puede encontrar más información detallada en:
 http://bit.ly/jlPRjU
 ó en
http://bitly.com/Q7gsqQ

 Lo que ha estado ocurriendo en Estados Unidos y Canadá desde finales del 2011 y casi al cierre del año 2012, es que se han seguido presentando una serie de brotes en productos cárnicos y de otro tipo, principalmente por E.coliO157:H7 y algunos cuantos casos ligados a las Top STEC. El reconocido abogado en Seguridad Alimentaria de Estados Unidos, ha sido el principal artífice de que el Departamento de Agricultura por medio de su Servicio de Inspección Federal Sanitaria (FSIS) declarara oficialmente a las Top STEC como adulterantes en alimentos de origen cárnico (que es su grado de jurisdicción)equiparables a la E.coliO157:H7 por su peligrosidad y que a partir del 4 de Junio del presente año, su presencia confirmada en alimentos tendría un tratamiento sanitario equivalente a productos contaminados con la E.coliO157:H7. 

Este dato apareció publicado en: 

9 CFR Parts 416, 417, and 430 [Docket No. FSIS–2010–0023] Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Certain Raw Beef Products 

Con esta nueva regulación, el gobierno de Estados Unidos está obligando a que todos los productores cárnicos de su país y del resto de mundo que tomen todas las medidas sanitarias apropiadas para evitar que esta generación de microorganismos patógenos ingresen a la cadena de distribución y puedan llegar hasta los consumidores finales. El riesgo principal que genera la E.coliO157:H7 y las bacterias no-O157, que producen dicha Shigatoxina, es que tienen dosis infectivas mínimas (la mayor parte menos de 100 ufc/gr  de alimento son suficientes para producir una infección) y que pueden llegar a producir el Sindrome de Uremia Hemolítica (SUH ó HUS por sus siglas en inglés) el cual inhabilita el funcionamiento del riñón generando una insuficiencia renal crónica que obliga en casos extremos a la hemodiálisis de por vida ó transplante renal y en los grupos de alto riesgo como niños, ancianos y personas inmunosuprimidas (trasplantadas, enfermas de Cáncer o Sida) suele ser mortal en un porcentaje que puede llegar a tasas hasta del 30-40% de los enfermos. 

En la empresa para la cual prestamos nuestros servicios, se cuenta con una de las metodologías más efectivas que se han desarrollado hasta ahora para el análisis y monitoreo tanto de la E.coliO157:H7 como de las TopSTEC. La Tecnología se llama Assurance GDS y en una entrada previa hemos hablado de la misma. 

 Continuaremos ahondando en detalles de esta tecnología próximamente.

Trazabilidad de Materias Primas y Norma Oficial Mexicana 251

El papel de la trazabilidad de las materias primas y la Norma Oficial Mexicana 251

Con la globalización del suministro de alimentos y la aparición de nuevos retos para la salud pública incluyendo variedades de microorganismos patógenos con multirresistencia a los tratamientos con antibióticos, resistencia a ciertos sanitizantes, gérmenes con nuevas capacidades de daño al ser humano como la generación de enterotoxinas hemorrágicas que antes se conocían solo para bacterias como E.coliO157:H7, los procesadores de alimentos se enfrentan a una realidad completamente diferente a la existente tan sólo 10 años atrás.

Los requerimientos para tener un plan exitoso de calidad e inocuidad en los alimentos han tenido que evolucionar a la par de los nuevos riesgos presentes, de manera particular con los microorganismos patógenos. El sector de productos cárnicos y lácteos es particularmente sensible a los mismos, dado su alto riesgo de contaminación.

Ante este escenario, la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (Cofepris) y la participación de toda la industria de alimentos, generó una norma oficial que sustituye a las normas 120 y 093, que regían las buenas prácticas de manufactura y procedimientos sanitarios para todo el sector de alimentos y bebidas, incluyendo ahora también los suplementos alimenticios.

Dado que esta Norma Oficial es bastante extenso, hay un tema en particular que pretendemos tocar en esta edición: la trazabilidad de las materias primas.

La norma señala en el respectivo inciso: 3.40 Rastreabilidad/rastreo de los productos, la capacidad para seguir el desplazamiento de un alimento, bebida o suplemento alimenticio a través de una o varias etapas especificadas de su proceso

A su vez, en la sección 6.6 Documentación y registros, estipula en la tabla 2, respecto a las materias primas: El certificado de calidad, reporte o registro (correspondiente a la recepción de materias primas y material de envase y/o empaque) deberá contener al menos Nombre de producto o clave, fecha, proveedor, origen, cantidad, lote y marca; resultado de la evaluación, información que permita identificar a la persona que realizó la evaluación. Cuando se identifiquen con clave, esta debe permitir la rastreabilidad del producto.

¿Cuál es la importancia para su empresa como procesador de alimentos?
• Usted y sus proveedores son corresponsables de la inocuidad
• La cultura de productos inocuos empieza desde su origen en el campo de producción y debe identificar los riesgos asociados a los productos que compra dentro de su plan de inocuidad
• Debe exigir en lo sucesivo a todos sus proveedores un certificado de calidad que sea auditable y verificable por la autoridad sanitaria
• Todas las materias primas que incluya en cada de sus productos terminados tienen que tener la posiblidad y los registros para seguirlos hasta su origen, especialmente para adulterantes como plaguicidas, toxinas, microorganismos patógenos, residuos de antibióticos y similares.
• Las empresas que no auditen a sus proveedores y confíen en la calidad de las materias primas sin tener documentos probatorios y auditables, están ahora en riesgo sanitario elevado si la autoridad les detecta un producto terminado contaminado en el mercado.
• La cultura de la inocuidad y la seguridad de los alimentos en México, tiene que ser desde la granja o campo de producción hasta la mesa del consumidor final. La normatividad actual en el País, se ha homologado finalmente con lo que existe en Estados Unidos y Europa desde hace muchos años: Planes HACCP o de inocuidad total para la producción de alimentos.

Contrario a lo que pudiera parecer, esta normatividad solamente hace obligatorio lo que ya era un práctica común entre empresas grandes y lo generaliza para empresas pequeñas y medianas, que representan más del 80% del mercado en México.

Si tiene alguna duda respecto a la trazabilidad de sus materias primas y requiere algún tipo de apoyo al respecto, comuníquese con el suscrito quien con gusto le brindaremos información adicional.

Tecnología de PCR para detección de patógenos

Después de una pequeña pausa, empezaremos a comentar con una frecuencia al menos semanal, de los tópicos que nos llevaron a crear este blog.

El tema de hoy es La Tecnología de PCR para detección de patógenos.

Desde los primeros tiempos en que empezaba la microbiología como la conocemos hoy, hacia finales del siglo XIX, con las investigaciones del Dr. Pasteur, el Dr. Koch, Samuel Petri, el Dr. Salmon y muchos renombrados individuos que pueden ser considerados como los iniciadores y que dejaron su huella para la posteridad, el ser humano se ha visto en la creciente necesidad de buscar encontrar, detectar y monitorear los seres biológicos invisibles que hoy en día conocemos a nivel genérico como microorganismos o microbios.

Este fascinante mundo, que en términos reales fueron los que primeros seres vivos que existieron sobre la Tierra (por ser la mayoría de ellos seres vivos unicelulares ó conformados por una sola célular) sigue siendo tema de estudio permanente desde esos tiempos y afortunadamente para la raza humana, se han seguido mejorando notablemente las diferentes metodologías de análisis para poder dictaminar su existencia hasta género y especie.

Hablando en términos específicos para monitoreo de microorganismos patógenos, como los que hemos hablado en temas anteriores, específicamente para tres de los microorganismos que más enfermedades causan en el ser humano y que son transmitidos mayoritariamente por consumo o ingesta de alimentos contaminados, a saber: Salmonella, Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7 (EHEC) existen tres grandes grupos de pruebas para detectarlos:

1) Microbiología tradicional en agares, caldos y serología.

2) Detección inmunológica rápida por anticuerpos en varios formatos:
Formatos de ELISA
Formatos de Inmunoprecipitación en Látex
Formatos de Inmunodifusión
Formatos de Inmunocaptura Magnética

3) Detección mediante Análisis del Material Genético de los microbios usando la tecnología de PCR (Polimerase Chain Reaction) ó de Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés.

En esta entrega del blog, comentaremos con cierto detalle qué es el PCR.

En términos muy entendibles, recordemos que todos los seres vivos y los virus (que no se consideran a nivel biológico como seres "vivos" en toda la extensión de la palabra, pero que son entes biológicos o seres que tienen características especiales) están constituidos de varios sistemas que mantienen las células que los conforman. En todos los casos, la estructura biológica por excelencia encargada de darle la "forma" a cada ser vivo, es el Acido Desoxirribonucleico o ADN (DNA en inglés). Este componente, se encuentra en los cromosomas de cada ser vivo y en el núcleo de cada microorganismo.

El ADN, es 100% único para cada ser vivo. Al ser formado por una cadena de 4 moléculas llamadas nucleótidos con sus respectivos pares complementarios y que forma una cadena o doble hélice con tramos tan cortos como 100 pares hasta varios millones, como en algunos genes humanos, existen trillones de combinaciones en esa cadena. Por la misma razón, pueden existir trillones de individuos con características totalmente distintas entre sí.

La tecnología de PCR ha tomado ventaja de esa peculiaridad del ADN y por medio del aislamiento de una parte o sección de la cadena de doble hélice, mediante un dispositivo biológico llamado Sonda y con la ayuda de una enzima especial conocida como TAQ POLIMERASA, cuya función es crear un número indeterminado de copias de fragmentos del ADN creando polímeros o copias idénticas de los los mismos, ha revolucionado por completo el mundo diagnóstico creando de facto, la disciplina que hoy llamamos Biología Molecular.

Los elementos que requiere esta tecnología son:
1) Primers
2) Sonda
3) Target u Objetivo
4) Taq Polimerasa
5) Termociclador de punto final ó de Tiempo Real
6) Sistema para detectar las copias al final (Electroforesis en gel, curvas de fusión por fluorescencia, curvas de producción de copias marcadas con fluorescencia (PCR Tiempo Real)
7) Control interno

Cada uno de los elementos cumple con una función específica:
1) Los primers es la secuencia específica de nucleótidos del ADN que son específicos del organismo que estamos tratando de detectar.

2) La sonda, que en el caso de los sistemas de Tiempo real suele ir marcada en los extremos, con un elemento conocido como Quencher (o amortiguador) y con otro que es un agente Fluorogénico o Fluoróforo. Se puede describir como una sección complementaria para los primers del microorganismo que estamos buscando detectar.

3) El target u objetivo es la secuencia simple complementaria a la que la sonda se unirá para generar su duplicación "n" veces en el ciclo que llamamos amplificación.

4) La Taq Polimerasa, es una enzima aislada del microorganismo Thermus aquaticus, encontrado en las fuentes termales de Yellowstone, Estados Unidos. Esta enzima es la responsable de generar copias o formar "polímeros" del target u objetivo, si tiene las condiciones necesarias de temperatura, acidez y oligoelementos como el cloruro de magnesio en una solución acuosa.

5) El termociclador es un dispositivo diseñado para generar de manera alterna condiciones de temperatura en rangos de 55 hasta 95°C, que permiten que la Taq Polimerasa pueda cumplir con su función de generado de copias o "amplificar" el ADN. Existen dos tipos básicos: Los de gradiente de temperatura en bloque sólido (aquí entran los de compañías como Applied Bioresearch, los de Qualicon, BioRad y otros más) y los rotativos (como el RotorGiene de Corbett Research, ahora de QIAGEN y los LightCyclers de Roche). Normalmente corren 40-50 ciclos en períodos desde 60 segundos hasta poco menos de 5 minutos; por lo cual el proceso de termociclado demora desde 45 mins hasta 3-4 horas.

6) El sistema más usado para detectar las copias generadas hasta hace poco menos de 20 años eran los sistemas de electroforesis en gel; en los últimos 10 años, surgió con más fuerza el uso de fluoróforos como el SYBR-GREEN, para poder medir la curva de fusión de los ciclos de amplificación y en los últimos 5 años, ha tomado más fuerza el uso de equipos termocicladores Tiempo Real, que usan fluoróforos altamente específicos y selectivos, que permiten incluso cuantificar concentraciones en función de las curvas de generación de la fluorescencia (en todos los casos anteriores, el termociclador tiene acoplado el sistema para detectar el SYBR-Green u otros fluoróforos; sólo para la electroforesis en gel se hace en equipos por separado).

7) El uso de controles internos se ha extendido cada vez más para demostrar, comprobar, verificar y validar al mismo tiempo que realmente ocurrió la reacción de amplificación. Estos suelen añadirse en los tubos de reacción o en los capilares que se introducen en el termociclador.

Para terminar esta descripción general sobre la Tecnología de PCR, cabe señalar que son cada vez más las empresas de todo tipo a nivel mundial y especialmente aquellas que elaboran productos sensibles a nivel microbiológico como las de alimentos congelados para consumo inmediato (RTE por las siglas en inglés), de alimentos para niños y/o fórmulas nutricionales, empresas de cárnicos procesados, empresas de productos lácteos frescos y procesadoras de alimentos orgánicos, las que han adoptado el uso comercial de esta tecnología.

Si usted está realmente interesado en alguna, busque que incluya preferentemente algun sistema de concentración de la muestra mediante un proceso como la Inmunoseparación Magnética (IMS en inglés), que es la tendencia de esta tecnología. Usar IMS acoplada con PCR Tiempo Real para buscar resultados en mucho menor tiempo de lo que tarda el método tradicional o pruebas inmunológicas como las que mencionamos anteriormente.

Actualización al Mes de Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs