Ensayos de Flujo Lateral para Determinación de Alérgenos

Ensayos de Flujo Lateral para Determinación de Alérgenos

Hace ya algún tiempo, publicamos la siguiente entrada referente al control de Alergenos en Alimentos, en un blog hermano que llevamos con fines comerciales:
https://serco-microbiologia.blogspot.mx/search?q=aLERGENOS

El día de hoy ahondaremos sobre las metodologías disponibles para control de Alergenos.

Los ensayos para detección de alérgenos se enfocan en detectar por medio de inmunología (Flujo Lateral, ELISA) ó PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) a secciones de las proteínas consideradas como alergénicas.

Existen muchos estudios de todas las gamas de alimentos reconocidas como alergénicas, pero el consenso internacional está enfocado a 8 grandes grupos:
1) Proteínas de la leche (caseína, lactoalbúmina, Beta lactoglobulina)
2) Proteínas del huevo
3) Proteínas del Trigo o granos que contengan Gliadina ó Gluten
4) Proteínas del Cacahuate
5) Proteínas de mariscos y crustáceos e Histamina
6) Proteínas de nueces de árbol (Nuez común, nuez de california, nuez de castilla, nuez de macadamia, nuez de brasil)
7) Proteínas de frutos secos como Avellanas, Almendras, Pistaches
8) Proteínas de mostaza, lupina y sésamo-ajonjolí.

Los fabricantes para este tipo de ensayos que han sido más ampliamente adoptados por la industria de alimentos, son las de flujo lateral.

¿Qué particularidades tienen estos ensayos?
1) Son rápidas, el tiempo total para correr el ensayo oscila entre 8 y 20 minutos totales.
2) Para efectos prácticos, son las únicas que se pueden usar en campo ó a nivel de línea de producción en comparación a las pruebas de ELISA ó de PCR que tienen que llevarse a cabo forzosamente en un laboratorio con equipamiento especializado.
3) No requieren de ningún tipo de dispositivos o equipos para llevarlas a cabo.
4) Son las más conocidas del mercado porque su funcionamiento es equivalente al de las pruebas de embarazo domésticas para las personas.
5) Se consideran  semicuantitativas, porque tienen un nivel mínimo de detección y por ende, si son negativas, garantizan ausencia del alérgeno buscado (en la superficie ó muestra analizada, importante aclaración) a un punto de corte/detección y si son positivas, indican que hay al menos un nivel medible en partes por millón de la molécula alergénica buscada.
6) Sus niveles de detección oscilan entre 1 y 5 partes por millón (ppm) en lo general.
7) Están diseñadas de origen para detección de TRAZAS de alérgenos. Es decir, si una persona quisiera tratar de probarlas con un superficie ó en un producto con más de 1% de contenido de la proteína buscada, se saturan y marcan AUSENCIA.  Se le conoce como efecto Gancho ó Hook.

El funcionamiento de estos ensayos sigue exactamente el mismo principio que describimos en una colaboración previa.   Le invito a que lo pueda revisar en:
http://iso22000yhaccp.blogspot.mx/2018/01/pruebas-de-flujo-lateral-para-analisis.html

Si desea información adicional, nos puede contactar en luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le remitimos con quien corresponda.  En la República Mexicana, se pueden encontrar al menos 4 compañías que cuentan con diferentes marcas comerciales.  El interfecto trabaja en la Dirección Comercial de una de las mismas; sin embargo, es importante que el usuario final que desee implementar un plan de control de alérgenos, exija que la empresa que seleccione, le apoye de principio a fin para dicho plan, con todas las herramientas con la que pueda ser apoyada.

Por ahora, hacemos una pausa.

Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Pruebas de Flujo Lateral para Análisis de Patógenos como Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 y similares

Cuando una empresa decide adoptar la posibilidad de realizar un ensayo rápido para "screening" o tamizaje de un microorganismo patógeno, una de las opciones más populares y con mayor cantidad de opciones en el mercado a nivel internacional, es la Tecnología de Flujo Lateral (o Lateral Flow Device = LFD por las siglas en inglés).

¿Qué son estas pruebas y cómo funcionan o cuál es el fundamento?

La explicación más simple para personas adultas no expertas en temas de microbiología, que alguna vez fueron o hayan sido padres de familia, son las pruebas de embarazo rápido que se pueden comprar en cualquier farmacia.  En estas pruebas, se detecta una hormona en muestras de orina, específicamente la GCH Gonadotropina Coriónica Humana, la cual es producida por el embrión como un mecanismo de defensa para evitar ser expulsado del útero materno y que pueda implantarse en la placenta.

El mecanismo con el que esta hormona es detectado es exactamente el mismo principio que se usa en la mayoría de las pruebas de flujo lateral.

Los componentes de ensayo incluyen:

1) Base o Tira de Celulosa por la que corre el ensayo.

2) Set de antígenos marcados con oro coloidal específicos para el contaminante a buscar.

3) Set de antígenos de control marcados con oro coloidal que sirven como control interno y de calidad para verificar que el ensayo funcionó exitosamente.

A continuación, colocamos una secuencia de imágenes de los pasos que ocurren durante el ensayo:

1) A la tableta ó tira, se le añaden normalmente de 100 a 200 microlitros de la solución donde se pre-enriqueció la muestra en la que estamos buscando el patógeno o contaminante.  Si es un dispositivo tipo tableta, tiene un pequeño orificio donde se inocula dicha muestra.  Si es una tira simple, normalmente se inserta en un tubo con la muestra para que el flujo corra hacia arriba en la membrana de celulosa.

2) Como es una prueba inmunológica Antígeno-Anticuerpo, ambas moléculas son proteínas que funcionan como una llave-cerradura. Es decir, son complementarias y específicamente diseñadas a  nivel biológico para acoplarse mutuamente.  En la membrana de celulosa, se "carga" o embebe un complejo de oro coloidal con antígenos específicos para los anticuerpos de la bacteria o contaminante deseado y otro bloque que servirá como control de calidad.  El fluido arrastra este complejo de izquierda a derecha ó de abajo hacia arriba, para ir generando la reacción deseada.

3) Este complejo arrastrado, al pasar por la sección para detectar si están presentes los anticuerpos deseados, genera una precipitación del oro coloidal al generarse una especie de sandwich en la que el anticuerpo de la bacteria que se había unido a los antígenos del complejo de oro coloidal, precipita o completa un bloque de antígeno-anticuerpo-antígeno que se denota como una línea de color rojo (por el oro coloidal).

4) La prueba se completa cuando el complejo de oro coloidal inicial termina y embebe la parte final de la membrana de celulosa, en la que se cargaron anticuerpos complementarios de control para que precipiten con los antígenos de control iniciales. Esta reacción permite detectar que la muestra corrió hasta el final y que se están dando reacciones antígeno-anticuerpo precipitadas con oro coloidal, independientemente si hubo o no anticuerpos del germen o contaminante deseado, que precipitarían en la primera línea ó de prueba/muestra.

Una manera muy coloquial para explicar lo anterior, es equiparar al complejo precipitado como un sandwich de jamón simple.  En esta analogía, la tapa superior del pan es el complejo de antígeno bañado con oro coloidal y la tapa inferior del pan es el complemento para que precipite.  Lo que completaría este sandwich, sería la rebanada de jamón.  En este caso, los anticuerpos de la bacteria ó contaminante buscados serían el equivalente a esa rebanada de jamón. Cuando el sandwich se completa, es como si las tapas estuvieran impregnadas de salsa de tomate y cambian de color blanco al rojo de dicha salsa de tomate.

Los ensayos de flujo lateral tienen más de 50 años en el mercado, pero su uso se ha vuelto extremadamente popular para aplicaciones en microbiología de alimentos y sanitaria en los últimos 25 años.

Ventajas que tienen:

1) Simpleza para llevarse a cabo

2) Fáciles de implementar en empresas/laboratorios de cualquier tamaño

3) Las puede realizar casi cualquier persona

4) Lectura muy sencilla

5) Si los componentes de los antígenos son de alta calidad, son MUY precisas y confiables

6) Suelen ser económicas

7) Tienen incorporado un control interno que permite saber si funcionaron o no

8) En el caso de la detección de bacterias patógenas, requieren normalmente de una concentración entre 100,000 y 1,000,000 (1x10 a la 5 ó 1x10 a la 6) células viables para que se forme una reacción colorida claramente visible.  En concentraciones menores de 1000 hasta 10,000 no se forman lineas suficientemente claras y tendrían a dar resultados falsamente negativos.

Por ahora, hacemos un pausa.  Si usted desea conocer más sobre la implementación de uno de estos ensayos para detección de Salmonella, Listeria, E.coliO157:H7 ó algún otro contaminante, escríbanos a luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le podemos remitir con quien pueda asesorarle directamente en su lugar de origen o trabajo.

Opciones para análisis rápido de Clenbuterol (y otros B-Agonistas)

Para todas las personas que habitamos en la República Mexicana, independientemente de nuestra ocupación, el término de "clenbuterol (clembuterol)" se nos hace fuertemente familiar.
En el año 2012, a cinco jugadores de la Selección Nacional de Futbol se les detectó la presencia de clenbuterol en pruebas antidopaje y eso ocasionó un escándalo mayúsculo porque se le asoció al consumo de carne contaminada con este producto.
¿Qué es el clenbuterol (clembuterol)?  Forma parte de una familia de compuestos de origen orgánico conocida como Beta agonistas del grupo de los Beta adrenérgicos. Tiene efectos sobre la promoción de masa muscular, la reducción de grasa corporal y manifiesta un impacto sobre el aparato respiratorio y circulatorio.
Debido a estos efectos, se llegó a utilizar con bastante frecuencia dentro del pienso para animales para estimular el crecimiento de tejido muscular aprovechable para ganado de engorda con la generación de mayores ingresos por la comercialización de la misma.
A finales de los 90´s, se descubrió que podía generar intoxicaciones agudas en consumidores y empezó a prohibirse su uso como parte de la alimentación del ganado bovino, a nivel internacional.
En México está prohibido y regulado por parte de SAGARPA.

Ante la ola mediática de escándalos como los de la Seleccíón Mexicana ó la suspensión por 2 años del ciclista profesional de origen español, Alberto Contador, a quien inclusive se le retiraron 2 títulos de ganador del Tour de Francia, cada día más gente y consumidores de carne de res, incluyendo atletas de alto rendimiento, futbolistas profesionales y más, quieren estar seguros de que los platillos que ingieren no contienen esta sustancia.

El monitoreo de clenbuterol a nivel mundial ha estado circunscrito a ensayos de formato inmunológico de ELISA y/o ensayos de cromatografía de gases ó líquidos de alta resolución.  Sin embargo, por la alta complejidad en su formato y los equipos requeridos, con un inversión mínima de 8 a 10 mil dólares, ocasiona que sean pocos laboratorios y empresas las que realmente pueden monitorearlo.

Buscando en todo el mundo, encontramos una compañía ubicada en Shenzen, China que ha desarrollado una serie de ensayos por flujo lateral (LFD para Clenbuterol) para los betaAgonistas más comunes incluyendo al Clenbuterol, Salbutamol y Ractopamina.  Incluye también a otros compuestos usados en producción animal como Nitrofuranos (AOZ, AMOZ), Sulfonamidas, Tetraciclinas y Cloranfenicol.

La gran ventaja de una prueba de flujo lateral, es que se puede llevar a cabo en 10 minutos, sin inversión en equipo especializado, tienen una confiabilidad superior al 95%, los resultados son extremadamente sencillos de interpretar y que la puede realizar una compañía que no tiene que tener un laboratorio 100% dedicado a esto para hacer auditorías de sus proveedores.

El monitoreo o análisis rápido de clenbuterol con un ensayo de flujo lateral, entre otros beneficios para cualquier empresa usuaria de carne de res, es que no tiene que esperar varios días para obtener el resultado en un laboratorio externo; el análisis de clenbuterol por medio de flujo lateral y el nivel de sensibilidad, permite a su vez llevar un registro general ó un plan de auditorías a sus proveedores de ganado para sacrificio ó posterior corte, deshuese o procesado.

Para aquellos lectores interesados en este ensayo para análisis de clenbuterol por flujo lateral con una sensibilidad desde 3ppb, pueden seguir el vínculo: http://bit.ly/Clenbuterol-LFD.

Por ahora hacemos una pausa.