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domingo, 11 de febrero de 2018

Ensayos de Flujo Lateral para Determinación de Alérgenos

Ensayos de Flujo Lateral para Determinación de Alérgenos

Hace ya algún tiempo, publicamos la siguiente entrada referente al control de Alergenos en Alimentos, en un blog hermano que llevamos con fines comerciales:
https://serco-microbiologia.blogspot.mx/search?q=aLERGENOS

El día de hoy ahondaremos sobre las metodologías disponibles para control de Alergenos.

Los ensayos para detección de alérgenos se enfocan en detectar por medio de inmunología (Flujo Lateral, ELISA) ó PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) a secciones de las proteínas consideradas como alergénicas.

Existen muchos estudios de todas las gamas de alimentos reconocidas como alergénicas, pero el consenso internacional está enfocado a 8 grandes grupos:
1) Proteínas de la leche (caseína, lactoalbúmina, Beta lactoglobulina)
2) Proteínas del huevo
3) Proteínas del Trigo o granos que contengan Gliadina ó Gluten
4) Proteínas del Cacahuate
5) Proteínas de mariscos y crustáceos e Histamina
6) Proteínas de nueces de árbol (Nuez común, nuez de california, nuez de castilla, nuez de macadamia, nuez de brasil)
7) Proteínas de frutos secos como Avellanas, Almendras, Pistaches
8) Proteínas de mostaza, lupina y sésamo-ajonjolí.

Los fabricantes para este tipo de ensayos que han sido más ampliamente adoptados por la industria de alimentos, son las de flujo lateral.

¿Qué particularidades tienen estos ensayos?
1) Son rápidas, el tiempo total para correr el ensayo oscila entre 8 y 20 minutos totales.
2) Para efectos prácticos, son las únicas que se pueden usar en campo ó a nivel de línea de producción en comparación a las pruebas de ELISA ó de PCR que tienen que llevarse a cabo forzosamente en un laboratorio con equipamiento especializado.
3) No requieren de ningún tipo de dispositivos o equipos para llevarlas a cabo.
4) Son las más conocidas del mercado porque su funcionamiento es equivalente al de las pruebas de embarazo domésticas para las personas.
5) Se consideran  semicuantitativas, porque tienen un nivel mínimo de detección y por ende, si son negativas, garantizan ausencia del alérgeno buscado (en la superficie ó muestra analizada, importante aclaración) a un punto de corte/detección y si son positivas, indican que hay al menos un nivel medible en partes por millón de la molécula alergénica buscada.
6) Sus niveles de detección oscilan entre 1 y 5 partes por millón (ppm) en lo general.
7) Están diseñadas de origen para detección de TRAZAS de alérgenos. Es decir, si una persona quisiera tratar de probarlas con un superficie ó en un producto con más de 1% de contenido de la proteína buscada, se saturan y marcan AUSENCIA.  Se le conoce como efecto Gancho ó Hook.

El funcionamiento de estos ensayos sigue exactamente el mismo principio que describimos en una colaboración previa.   Le invito a que lo pueda revisar en:
http://iso22000yhaccp.blogspot.mx/2018/01/pruebas-de-flujo-lateral-para-analisis.html

Si desea información adicional, nos puede contactar en luis_quintanilla@hotmail.com y con gusto le remitimos con quien corresponda.  En la República Mexicana, se pueden encontrar al menos 4 compañías que cuentan con diferentes marcas comerciales.  El interfecto trabaja en la Dirección Comercial de una de las mismas; sin embargo, es importante que el usuario final que desee implementar un plan de control de alérgenos, exija que la empresa que seleccione, le apoye de principio a fin para dicho plan, con todas las herramientas con la que pueda ser apoyada.

Por ahora, hacemos una pausa.

viernes, 28 de noviembre de 2014

Opciones para análisis rápido de Clenbuterol (y otros B-Agonistas)

Para todas las personas que habitamos en la República Mexicana, independientemente de nuestra ocupación, el término de "clenbuterol (clembuterol)" se nos hace fuertemente familiar.
En el año 2012, a cinco jugadores de la Selección Nacional de Futbol se les detectó la presencia de clenbuterol en pruebas antidopaje y eso ocasionó un escándalo mayúsculo porque se le asoció al consumo de carne contaminada con este producto.
¿Qué es el clenbuterol (clembuterol)?  Forma parte de una familia de compuestos de origen orgánico conocida como Beta agonistas del grupo de los Beta adrenérgicos. Tiene efectos sobre la promoción de masa muscular, la reducción de grasa corporal y manifiesta un impacto sobre el aparato respiratorio y circulatorio.
Debido a estos efectos, se llegó a utilizar con bastante frecuencia dentro del pienso para animales para estimular el crecimiento de tejido muscular aprovechable para ganado de engorda con la generación de mayores ingresos por la comercialización de la misma.
A finales de los 90´s, se descubrió que podía generar intoxicaciones agudas en consumidores y empezó a prohibirse su uso como parte de la alimentación del ganado bovino, a nivel internacional.
En México está prohibido y regulado por parte de SAGARPA.

Ante la ola mediática de escándalos como los de la Seleccíón Mexicana ó la suspensión por 2 años del ciclista profesional de origen español, Alberto Contador, a quien inclusive se le retiraron 2 títulos de ganador del Tour de Francia, cada día más gente y consumidores de carne de res, incluyendo atletas de alto rendimiento, futbolistas profesionales y más, quieren estar seguros de que los platillos que ingieren no contienen esta sustancia.

El monitoreo de clenbuterol a nivel mundial ha estado circunscrito a ensayos de formato inmunológico de ELISA y/o ensayos de cromatografía de gases ó líquidos de alta resolución.  Sin embargo, por la alta complejidad en su formato y los equipos requeridos, con un inversión mínima de 8 a 10 mil dólares, ocasiona que sean pocos laboratorios y empresas las que realmente pueden monitorearlo.

Buscando en todo el mundo, encontramos una compañía ubicada en Shenzen, China que ha desarrollado una serie de ensayos por flujo lateral (LFD para Clenbuterol) para los betaAgonistas más comunes incluyendo al Clenbuterol, Salbutamol y Ractopamina.  Incluye también a otros compuestos usados en producción animal como Nitrofuranos (AOZ, AMOZ), Sulfonamidas, Tetraciclinas y Cloranfenicol.

La gran ventaja de una prueba de flujo lateral, es que se puede llevar a cabo en 10 minutos, sin inversión en equipo especializado, tienen una confiabilidad superior al 95%, los resultados son extremadamente sencillos de interpretar y que la puede realizar una compañía que no tiene que tener un laboratorio 100% dedicado a esto para hacer auditorías de sus proveedores.

El monitoreo o análisis rápido de clenbuterol con un ensayo de flujo lateral, entre otros beneficios para cualquier empresa usuaria de carne de res, es que no tiene que esperar varios días para obtener el resultado en un laboratorio externo; el análisis de clenbuterol por medio de flujo lateral y el nivel de sensibilidad, permite a su vez llevar un registro general ó un plan de auditorías a sus proveedores de ganado para sacrificio ó posterior corte, deshuese o procesado.

Para aquellos lectores interesados en este ensayo para análisis de clenbuterol por flujo lateral con una sensibilidad desde 3ppb, pueden seguir el vínculo: http://bit.ly/Clenbuterol-LFD.

Por ahora hacemos una pausa.

domingo, 30 de noviembre de 2008

Metodología para análisis de Salmonella

Métodos para detección de Salmonella en alimentos y bebidas.

Acorde al manual de bacteriología analítica (BAM) de los Estados Unidos, la norma oficial mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de salmonella en alimentos y la metodología de otros países como la Comunidad Económica Europea, el usar métodos de cultivo tradicionales sigue siendo la referencia más importante para la detección de microorganismos de interés sanitario para el ser humano.

Todos los métodos para detección de patógenos, involucran en mayor o menor grado las siguientes etapas:
1) Pre-enriquecimiento
2) Enriquecimiento Selectivo
3) Aislamiento Diferencial
4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas
5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas
6) Serología con anticuerpos específicos

Cada una de las etapas anteriores tiene una duración mínima de 24 a 48 horas, lo cual lleva a terminar el ensayo o análisis del patógeno en períodos no menores a 7 días en la mayoría de los casos. Para Salmonella, específicamente serían 9 días.

¿Cuál es el objetivo de cada una de las etapas?

Las describiremos brevemente a continuación.

1) El pre-enriquecimiento tiene como objetivo el desarrollo general de microorganismos del tipo similar a aquél que estamos buscando que se desarrollen por lo menos 2 o 3 logaritmos. Todos aquellos microorganismos que no son del mismo grupo (en el caso de Salmonella, aquellos diferentes al grupo Enterobacteriaceae) suelen ser inhibidos o tienen crecimiento marginal durante este paso. Los caldos más usados suelen ser el Lactosado, el Agua Peptonada Bufferada y el Caldo Soya Tripticaseína.

2) El enriquecimiento selectivo (E.S.) como su nombre lo indica, es buscar llevar a un nivel cercano al 1,000,000 de m.o./mL (10 a la 6) y neutralizar eficazmente a otros miembros que puedan tener un desarrollo similar en la microflora del alimento que se está analizando. En el caso específico de Salmonella, durante esta etapa se busca desarrollarla por encima de bacterias coliformes como E.coli, Citrobacter y Proteus. En esta etapa suelen usarse caldos selectivos como el Tetrationato, el Rappaport Vassiliadis y el Selenito Cistina.

3) Durante el aislamiento diferencial, se toma una asada del medio de E.S. y se re-siembra por estriado en una sola placa o máximo en la mitad de una placa de petri regular. El estriado debe ser lo suficientemente espaciado para que al término del mismo, puedan llegarse a seleccionar colonias puntiformes que puedan ser aisladas para el siguiente paso. Para el análisis de Salmonella, existen más de 5 formulaciones de agar ampliamente usadas entre los que están el Agar Entérico Hektoen, el Agar Verde Brillante, el Agar de Sulfito Bismuto, el Agar McConkey, el Agar XLD y el Agar Salmonella Shigella.

4) Las pruebas bioquímicas presuntivas se enfocan a buscar ciertas características bioquímicas relacionadas con motilidad o desarrollo de algún color, turbidez o precipitación sobre un agar o un caldo selectivo en tubo. Estas pruebas permiten descartar si bacterias con un desarrollo en agar muy parecido a la bacteria objetivo (para Salmonella, bacterias como Proteus vulgaris, E.coli y Citrobacter freundii y determinar en esta etapa si conviene continuar a la búsqueda del género y especie del microorganismo en el siguiente paso. Para Salmonella, los dos ensayos analíticos más comunes incluyen el uso del Agar Triple Azúcar Hierro (TSI) y el Agar Lisina Hierro (LIA).

5) Las pruebas bioquímicas confirmativas, acorde al manual de Bergley´s, son el conjunto de análisis específicos para determinación de género y especie de los microorganismos. Estas incluyen pruebas como el indol, Citrato de Simmons, Manitol, Urea, Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Acorde a los resultados de cada una de ellas, se determinan la identidad del microorganismo.

5) La Serología, usa Antisueros específicos para cada microorganismo que indican el detalle exacto de las características bioquímicas y fisiológicas. Casi todas ellas son por aglutinación en látex y suelen demorar de 1 a 3 días.

Cada uno de los ensayos anteriores, se puede consultar con más detalle acorde a BAM y la norma oficial mexicana de Salmonella en los siguientes hipervínculos:
www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html
www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/114ssa14.html
Lo comentado con anterioridad aplica de manera exclusiva para el análisis microbiológico oficial de Salmonella acorde al BAM o la NOM-114 en México. Existen algunas alternativas que pueden ser opciones para empresas interesadas en hacer un "screening" o monitoreo presuntivo de la bacteria con fines comerciales y de liberación de producto terminado ó materias primas así como monitoreos ambientales de superficies inertes y vivas.

En un archivo subsecuente hablaremos con detalle sobre ellas, por ahora sólo mencionaremos los formatos:

1) Inmunoprecipitación en látex
2) Inmunodifusión en agar y captura de anticuerpos
3) Ensayos inmunoenzimáticos tipo "sandwich" o de ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay)
4) Hibridación de RNA
5) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por las siglas en inglés
6) Inmunocaptura magnética (proceso conocido como IMS)

Continuaremos más adelante.

Información agregada en Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs