Breve historia de los Métodos Rápidos para Análisis Microbiológicos de Alimentos, Bebidas, Nutraceúticos y Muestras Ambientales

(Entrada reproducida y adaptada de un Editorial de la Revista Argentina de Microbiología, 2009, escrito por Gerardo Leota).

Métodos rápidos: una herramienta útil y práctica para el análisis microbiológico de los alimentos

Se define como “método rápido” a cualquier método destinado a la detección, el recuento, la caracterización y la subtipificación de microorganismos (patógenos y del deterioro) mediante el cual se obtienen resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los métodos convencionales. 

El desarrollo de métodos rápidos y automatizados constituye un área de la microbiología aplicada muy dinámica y en continua evolución. En las últimas cuatro décadas hubo numerosos avances en el desarrollo de métodos rápidos y desde hace 15 años este campo cobró gran importancia en investigación y en laindustria alimentaria.

Los métodos rápidos se basan en técnicas físico-químicas (películas de medios de cultivos
deshidratados generales o selectivos, sistemas para determinar el número más probable, medios
cromogénicos y fluorogénicos), bioquímicas (galerías miniaturizadas y automatizadas), inmunológicas (precipitación, aglutinación, inmunofluorescencia, citometría, radioinmunoensayo, enzimoinmunoensayo, inmunocromatografía, nefelometría, inmunomicroscopía) y moleculares (hibridación, PCR de punto final, PCR en tiempo real, ribotipificación, microarreglos, biochips).

Desde la década del 70, el desarrollo y la implementación de los métodos rápidos para la identificación de microorganismos evolucionaron en paralelo con los adelantos en otras áreas de la investigación científica, en particular con la generalización del uso de galerías de pruebas bioquímicas miniaturizadas.

A partir de la década del 80, el avance en la producción de anticuerpos monoclonales hizo posible el
desarrollo de pruebas inmunológicas de identificación, como el ELISA o la inmunocromatografía. En
1990, con el advenimiento de las técnicas de biología molecular comenzaron a utilizarse técnicas como la PCR, tanto para tamizaje como para la identificación de microorganismos y sus factores de virulencia.

A partir del año 2000, comenzó el desarrollo de biosensores y en menor medida de biochips y microarreglos.

El crecimiento exponencial de los métodos rápidos aplicados a la microbiología de los alimentos puede evidenciarse en la gran cantidad de equipos comerciales que se ofrecen en la actualidad con el objetivo de tener resultados rápidos, en tiempo real, exactos y de bajo costo. Por ejemplo, como consecuencia de la automatización, el estudio de genotipos bacterianos pasó de ser un proceso tedioso y lento a un método práctico que se puede aplicar en los ensayos microbiológicos cotidianos.

Al cierre de 2014, siguen existiendo avances en la automatización de los ensayos rápidos y la tendencia mundial es clara, los métodos y análisis rápidos continuarán evolucionando según los avances tecnológicos en la miniaturización y automatización lo permitan.

Según el Dr. Daniel C. Fung, la mayor autoridad mundial en metodologías y pruebas de Microbiología Rápida y Automatizada, ha predecido que llegará un día en que podamos hacer detecciones de microorganismos en tiempo real, ya sea en segundos o minutos y cada día la ciencia nos está acercando hacia el cumplimiento de dicha predicción.

Por ahora, hacemos una pausa.

Para aplicaciones de microbiología rápida con aprobaciones AOAC-OMA, una de las opciones de consulta es:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109652.htm (Documento archivado desde 2001 en el Manual de Bacteriología Analítica).

Metodología para análisis de Salmonella

Métodos para detección de Salmonella en alimentos y bebidas.

Acorde al manual de bacteriología analítica (BAM) de los Estados Unidos, la norma oficial mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de salmonella en alimentos y la metodología de otros países como la Comunidad Económica Europea, el usar métodos de cultivo tradicionales sigue siendo la referencia más importante para la detección de microorganismos de interés sanitario para el ser humano.

Todos los métodos para detección de patógenos, involucran en mayor o menor grado las siguientes etapas:

1) Pre-enriquecimiento

2) Enriquecimiento Selectivo

3) Aislamiento Diferencial

4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas

5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas

6) Serología con anticuerpos específicos

Cada una de las etapas anteriores tiene una duración mínima de 24 a 48 horas, lo cual lleva a terminar el ensayo o análisis del patógeno en períodos no menores a 7 días en la mayoría de los casos. Para Salmonella, específicamente serían 9 días.

¿Cuál es el objetivo de cada una de las etapas?

Las describiremos brevemente a continuación.

1) El pre-enriquecimiento tiene como objetivo el desarrollo general de microorganismos del tipo similar a aquél que estamos buscando que se desarrollen por lo menos 2 o 3 logaritmos. Todos aquellos microorganismos que no son del mismo grupo (en el caso de Salmonella, aquellos diferentes al grupo Enterobacteriaceae) suelen ser inhibidos o tienen crecimiento marginal durante este paso. Los caldos más usados suelen ser el Lactosado, el Agua Peptonada Bufferada y el Caldo Soya Tripticaseína.

2) El enriquecimiento selectivo (E.S.) como su nombre lo indica, es buscar llevar a un nivel cercano al 1,000,000 de m.o./mL (10 a la 6) y neutralizar eficazmente a otros miembros que puedan tener un desarrollo similar en la microflora del alimento que se está analizando. En el caso específico de Salmonella, durante esta etapa se busca desarrollarla por encima de bacterias coliformes como E.coli, Citrobacter y Proteus. En esta etapa suelen usarse caldos selectivos como el Tetrationato, el Rappaport Vassiliadis y el Selenito Cistina.

3) Durante el aislamiento diferencial, se toma una asada del medio de E.S. y se re-siembra por estriado en una sola placa o máximo en la mitad de una placa de petri regular. El estriado debe ser lo suficientemente espaciado para que al término del mismo, puedan llegarse a seleccionar colonias puntiformes que puedan ser aisladas para el siguiente paso. Para el análisis de Salmonella, existen más de 5 formulaciones de agar ampliamente usadas entre los que están el Agar Entérico Hektoen, el Agar Verde Brillante, el Agar de Sulfito Bismuto, el Agar McConkey, el Agar XLD y el Agar Salmonella Shigella.

4) Las pruebas bioquímicas presuntivas se enfocan a buscar ciertas características bioquímicas relacionadas con motilidad o desarrollo de algún color, turbidez o precipitación sobre un agar o un caldo selectivo en tubo. Estas pruebas permiten descartar si bacterias con un desarrollo en agar muy parecido a la bacteria objetivo (para Salmonella, bacterias como Proteus vulgaris, E.coli y Citrobacter freundii y determinar en esta etapa si conviene continuar a la búsqueda del género y especie del microorganismo en el siguiente paso. Para Salmonella, los dos ensayos analíticos más comunes incluyen el uso del Agar Triple Azúcar Hierro (TSI) y el Agar Lisina Hierro (LIA).

5) Las pruebas bioquímicas confirmativas, acorde al manual de Bergley´s, son el conjunto de análisis específicos para determinación de género y especie de los microorganismos. Estas incluyen pruebas como el indol, Citrato de Simmons, Manitol, Urea, Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Acorde a los resultados de cada una de ellas, se determinan la identidad del microorganismo.

5) La Serología, usa Antisueros específicos para cada microorganismo que indican el detalle exacto de las características bioquímicas y fisiológicas. Casi todas ellas son por aglutinación en látex y suelen demorar de 1 a 3 días.

Cada uno de los ensayos anteriores, se puede consultar con más detalle acorde a BAM y la norma oficial mexicana de Salmonella en los siguientes hipervínculos:

www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html

www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/114ssa14.html

Lo comentado con anterioridad aplica de manera exclusiva para el análisis microbiológico oficial de Salmonella acorde al BAM o la NOM-114 en México. Existen algunas alternativas que pueden ser opciones para empresas interesadas en hacer un "screening" o monitoreo presuntivo de la bacteria con fines comerciales y de liberación de producto terminado ó materias primas así como monitoreos ambientales de superficies inertes y vivas.

En un archivo subsecuente hablaremos con detalle sobre ellas, por ahora sólo mencionaremos los formatos:

1) Inmunoprecipitación en látex

2) Inmunodifusión en agar y captura de anticuerpos

3) Ensayos inmunoenzimáticos tipo "sandwich" o de ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay)

4) Hibridación de RNA

5) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por las siglas en inglés

6) Inmunocaptura magnética (proceso conocido como IMS)

Continuaremos más adelante.

Información agregada en Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs