Buscando en la web, encontramos una excelente fuente de información para redondear y enriquecer lo que hemos comentado en entradas previas de este blog.
Se anexa esta entrada referente a las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) para la producción de alimentos inocuos y/o libres de contaminantes biológicos, físicos o químicos de acuerdo al programa HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points) ó Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control por sus siglas en inglés.
Posteriormente se añadirán videos complementarios; este video es el primero de una serie.
jueves, 3 de diciembre de 2009
miércoles, 2 de diciembre de 2009
Video de Inocuo.TV respecto a Listeria monocytogenes
El siguiente vínculo presenta información sumamente interesante referente a Listeria monocytogenes y la inocuidad en productos hortofrutícolas. Está tomado directamente del portal de www.inocuo.tv
http://www.inocuo.tv/index.php?option=com_hwdvideoshare&task=viewvideo&Itemid=64&video_id=27
miércoles, 18 de noviembre de 2009
La Importancia de la higiene del personal en la Industria de Alimentos
¿Sabía ud. que más del 60% de las enfermedades transmitidas por alimentos tienen su origen en la vía de transmisión fecal-oral a través de las manos del personal, acorde con datos oficiales de la Secretaría de Salud en México, datos de la Organización Mundial de Salud e instituciones como la Administración para Drogas y Alimentos de Estados Unidos (FDA)?
Actualmente, muchas empresas mexicanas, con especial énfasis todas las que exportan sus productos, han implementado programas de monitoreo sanitario de su personal que manipula alimentos durante todo el proceso y aún a pesar de ello, siguen existiendo productos contaminados por manipulación inadecuada.
¿Hay alguna solución? Entrenamiento y monitoreo continuo sobre las técnicas del lavado efectivo de manos, sobre una base periódica y programada, además de auditar y recertificar la manera en que la gente está siguiendo las buenas prácticas para el lavado y la desinfección de las manos.
Cabe señalar que todas las bacterias y virus enteropatógenos de importancia sanitaria incluyendo Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, virus de la hepatitis A, B y C; Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringens y C.botulinum y Campylobacter jejuni o Campylobacter coli están incluidos dentro de esa ruta de transmisión fecal-oral (manos mal lavadas a equipo o superficies que a su vez contaminarán el producto terminado o a medio proceso).
Existen productos especialmente diseñados para permitirle al personal de aseguramiento de calidad el saber el grado de entrenamiento y la efectividad de la técnica seguida por los operadores en tiempo real. Existen simuladores bacterianos en el mercado que "simulan" la presencia de bacterias con polímeros plásticos que son visibles bajo luz ultravioleta de 365nm y son sumamente efectivos para poder entrenar al personal en la demostración física de la importancia de la higiene.
Hay otras alternativas como el uso de un kit que desarrollamos de manera interna en la empresa para la cual prestamos nuestros servicios que intitulamos como "Hands Check" y por un costo extremadamente reducido (menos de 1.50 USD por operador) se puede hacer un monitoreo de presencia-ausencia de coliformes totales y Escherichia coli en las manos de un operador con resultados tan rápidos como 4 horas y hasta un máximo de 18 horas. Si usted está leyendo el presente documento, por favor mande un correo a luis70@yahoo.com para que le pueda enviar información adicional directamente a su correo.
Continuaremos con más este tema posteriormente.
¿Sabía ud. que más del 60% de las enfermedades transmitidas por alimentos tienen su origen en la vía de transmisión fecal-oral a través de las manos del personal, acorde con datos oficiales de la Secretaría de Salud en México, datos de la Organización Mundial de Salud e instituciones como la Administración para Drogas y Alimentos de Estados Unidos (FDA)?
Actualmente, muchas empresas mexicanas, con especial énfasis todas las que exportan sus productos, han implementado programas de monitoreo sanitario de su personal que manipula alimentos durante todo el proceso y aún a pesar de ello, siguen existiendo productos contaminados por manipulación inadecuada.
¿Hay alguna solución? Entrenamiento y monitoreo continuo sobre las técnicas del lavado efectivo de manos, sobre una base periódica y programada, además de auditar y recertificar la manera en que la gente está siguiendo las buenas prácticas para el lavado y la desinfección de las manos.
Cabe señalar que todas las bacterias y virus enteropatógenos de importancia sanitaria incluyendo Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, virus de la hepatitis A, B y C; Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringens y C.botulinum y Campylobacter jejuni o Campylobacter coli están incluidos dentro de esa ruta de transmisión fecal-oral (manos mal lavadas a equipo o superficies que a su vez contaminarán el producto terminado o a medio proceso).
Existen productos especialmente diseñados para permitirle al personal de aseguramiento de calidad el saber el grado de entrenamiento y la efectividad de la técnica seguida por los operadores en tiempo real. Existen simuladores bacterianos en el mercado que "simulan" la presencia de bacterias con polímeros plásticos que son visibles bajo luz ultravioleta de 365nm y son sumamente efectivos para poder entrenar al personal en la demostración física de la importancia de la higiene.
Hay otras alternativas como el uso de un kit que desarrollamos de manera interna en la empresa para la cual prestamos nuestros servicios que intitulamos como "Hands Check" y por un costo extremadamente reducido (menos de 1.50 USD por operador) se puede hacer un monitoreo de presencia-ausencia de coliformes totales y Escherichia coli en las manos de un operador con resultados tan rápidos como 4 horas y hasta un máximo de 18 horas. Si usted está leyendo el presente documento, por favor mande un correo a luis70@yahoo.com para que le pueda enviar información adicional directamente a su correo.
Continuaremos con más este tema posteriormente.
martes, 17 de noviembre de 2009
Aspectos prioritarios para buscar en un Sistema de Bioluminiscencia de ATP
La tecnología de Bioluminiscencia de ATP, permite la liberación de todo tipo de equipos y superficies de contacto, incluyendo guantes, mandiles e indumentaria del personal de empaque, en tan sólo 12 segundos, mediante la reacción de bioluminiscencia de ATP. Es 10,000,000 de veces más sensible que el ojo humano y por ello su alta confiabilidad. También cuenta con la opción de liberación de líquidos procedentes de lavados por recirculación como CIP en los mismos 12 segundos.
Es muy importante que busque un sistema de bioluminiscencia de ATP que le garantice que todos los datos registrados no sean editables y sean 100% auditables mediante el sistema de análisis de datos del mismo, preferentemente basado en algún formato como Excel de Windows. Mientras más puntos de muestreo logre configurar (hay equipos con 50, 200 y hasta 1000 puntos configurables) y almacenar; en esa medida podrá tener un historial estadístico más completo.
Algunas consideraciones adicionales:
*Busque portabilidad en su sistema de bioluminiscencia de ATP.
*Busque que tenga batería de Litio-MH como las que se usan en la tecnología celular para que garantice rendimiento óptimo el 100% del tiempo.
*Hay algunos equipos o sistemas de Bioluminiscencia de ATP que usan Fotodiodos y otros que usan PMT. Los estudios más serios indican que los que usan PMT realmente son más sensibles y precisos que aquellos que usan fotodiodos (aunque los fabricantes de los equipos con fotodiodos dicen exactamente lo contrario).
*Busque algún equipo que no tenga interferencia por sanitizantes o productos químicos para higiene y desinfección; recuerde que la reacción de bioluminiscencia de ATP es afectada por ellos.
*Recuerde que cualquier medición de ATP con un sistema de Bioluminiscencia es biocarga total; si quiere usarlo para múltiples funciones amparado en ATP, su imprecisión será elevada.
En otro post discutiremos más ampliamente el tema de Sistemas de Bioluminiscencia de ATP.
lunes, 16 de noviembre de 2009
Análisis de Listeria monocytogenes
El monitoreo y análisis de Listeria monocytogenes es uno de los más demandantes entre los microorganismos patógenos.
Las características del lento desarrollo de este microorganismo, lo hacen particularmente especial para ser detectado mediante la microbiología tradicional.
Los pasos a seguir son virtualmente idénticos al del resto de los microorganismos patógenos:
1) Pre-enriquecimiento (para pre-seleccionar y acondicionar al microorganismo para el siguiente c/paso)
2) Enriquecimiento selectivo (donde se busca generar de pasar de 1ufc/g hasta 1,000,000 ufc/g o hacerlo crecer 6 logaritmos; para que pueda ser detectado por el método tradicional posterior ó alguna de las técnicas rápidas existentes en el mercado como el PCR, la tecnología ELISA o sus variantes, la inmunoprecipitación visual en látex o con oro coloidal y similares).
3) Enriquecimiento diferencial (los pasos previos suelen ser regularmente en caldos por el mejor desarrollo en medio líquido que el agar; en este paso se busca aislar el microorganismo para generar colonias puras que luego puedan ser detectadas mediante pruebas bioquímicas presuntivas, confirmatorias o serológicas posteriormente).
4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas (Se corre una serie de pruebas para buscar diferenciar las colonias puras que se hayan seleccionado por características morfológicas como forma, color, brillo y/o similares acorde a la literatura reportada)
5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas (Con los resultados de las pruebas presuntivas, se tiene suficiente evidencia para seleccionar una batería de análisis bioquímicos altamente específicos que son exclusivos del microorganismo objetivo).
6) Pruebas Serológicas (Se busca la confirmación detallada de género y especie del microorganismo con pruebas de de antígeno-anticuerpo o serológicas que básicamente permiten la confirmación de la identidad del germen sin dejar lugar a dudas).
En el caso específico de Listeria monocytogenes y dado que la prueba es extremadamente larga y con múltiples pasos detallados, se presenta un resumen de los pasos a seguir (anexamos dos vínculos de hipertexto detallados para su posterior consulta; el manual BAM de Estados Unidos y la Norma Oficial Mexicana 143 :
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/143ssa15.html
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm071400.htm
La técnica se usa con 25 ó 375 gramos de muestra de alimento ó 1mL de buffer residual de monitoreo con hisopo de dacrón o rayón usando un hisopo con Buffer neutralizante como el SRK de Copan, el caldo Letheen o similares) ó 10mL de buffer residual para monitoreo con esponja de celulosa estéril -el modelo más usado en el mundo son las bolsas Whirlpack de Nasco; vea la página de Nasco -www.enasco.com- para más detalles en cualquier parte del mundo o solicite informes en www.serco.com.mx si ud. desea adquirir alguna en México.
El primer paso es pre-enriquecer siguiendo la proporción 1:9 (25 en 225mL ó 1 en 9mL ó 375 en 3375 mL de medio de cultivo) durante un mínimo de 24-48 horas. Puede usarse caldo fraser modificado con cloruro de litio ó caldo UVM ó caldo Demi Fraser o Caldo de Enriquecimiento para Listeria con suplementos como PALCAM u otros) ó Caldo Soya Tripticaseína con 0.5% de extracto de levadura. Listeria monocytogenes es un microorganismo que crece en un rango muy amplio de temperaturas; universalmente se desarrolla mejor a una temperatura inferior al rango de enterobacterias: 30°C en vez de 35 a 37°C.
Posteriormente, el enriquecimiento selectivo se hace con Caldo de Enriquecimiento Bufferado para Listeria adicionado con Sales y Ácido MOPS ó según la técnica puede usarse el mismo Caldo Demi Fraser ó algún medio UVM modificado (por 24 a 48 hrs. adicionales a 30°C).
Al terminar el pre-enriquecimiento o la combinación del mismo con el enriquecimiento selectivo, suelen correrse los análisis rápidos de Screening que reconoce BAM. Para cualquier persona física o moral interesada en México en saber más al respecto, anexo un vínculo de una presentación comercial intitulada Listeria 2009.xls donde se describen métodos comercializados por Serco Comercial que tienen aprobación AOAC-OMA.
http://mail.serco.com.mx/apps/ierm/faqs.nsf/90c9ef7d3fabe69886256fff00019e34/bb83ca2ea41b4a768625725f007f1361/$FILE/LISTERIA%202009.xls
Se continúa con el enriquecimiento diferencial en placas. Los agares preferidos incluyen:
1) Agar MOX
2) Agar Oxford
3) Agar PALCAM
4) Agar LPM
5) Cromagar Listeria
6) ALOA (Agar Cromogénico Selectivo para Listeria)
Cada uno de ellos tiene un crecimiento específico para Listeria monocytogenes y para los demás microorganismos del género Listeria. En el caso de L.m. suelen ser negras con un halo negro o negruzco alrededor de las mismas en medios que contienen sales de esculina. Este paso conlleva 24 a 48 horas adicionales a 30°C.
Una vez que se tomaron las colonias representativas, la batería de pruebas bioquímicas presuntivas incluyen:
1) Prueba de movilidad (10min)
2) Prueba de Catalasa (10min)
3) Tinción de Gram (16-24 hrs)
Y las confirmatorias:
1) Beta hemólisis a 35°C por 48 hrs.
2) Movilidad en medio SIM por 7 días a temp. ambiente (25°C)
3) Reducción de nitratos a 35°C por 5 días
4) Prueba de CAMP a 35°C por 24-48 hrs.
Las pruebas finales para confirmación incluyen serología en Caldo Triptosa por 24- 48 horas adicionales (incubación a 30°C) para determinar si corresponde a los serotipos 1, 4 u otros.
Aunque se ha descrito de manera muy general el análisis y monitoreo de Listeria monocytogenes, al nivel de uso en plantas procesadoras de alimentos que conlleven un riesgo en el producto, desde el punto de vista técnico y económico, usar una prueba rápida para hacer un "screening" o detección previa de la existencia del germen, se ha convertido en la práctica más comúnde las empresas a nivel mundial. Esta bacteria es tan peligrosa, que debe acentuarse su detección a nivel de pre-operacional y operacional, especialmente en superficies de contacto, directo o indirecto más lugares húmedos y medio ambiente (sistema de aire y ventilación).
Las características del lento desarrollo de este microorganismo, lo hacen particularmente especial para ser detectado mediante la microbiología tradicional.
Los pasos a seguir son virtualmente idénticos al del resto de los microorganismos patógenos:
1) Pre-enriquecimiento (para pre-seleccionar y acondicionar al microorganismo para el siguiente c/paso)
2) Enriquecimiento selectivo (donde se busca generar de pasar de 1ufc/g hasta 1,000,000 ufc/g o hacerlo crecer 6 logaritmos; para que pueda ser detectado por el método tradicional posterior ó alguna de las técnicas rápidas existentes en el mercado como el PCR, la tecnología ELISA o sus variantes, la inmunoprecipitación visual en látex o con oro coloidal y similares).
3) Enriquecimiento diferencial (los pasos previos suelen ser regularmente en caldos por el mejor desarrollo en medio líquido que el agar; en este paso se busca aislar el microorganismo para generar colonias puras que luego puedan ser detectadas mediante pruebas bioquímicas presuntivas, confirmatorias o serológicas posteriormente).
4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas (Se corre una serie de pruebas para buscar diferenciar las colonias puras que se hayan seleccionado por características morfológicas como forma, color, brillo y/o similares acorde a la literatura reportada)
5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas (Con los resultados de las pruebas presuntivas, se tiene suficiente evidencia para seleccionar una batería de análisis bioquímicos altamente específicos que son exclusivos del microorganismo objetivo).
6) Pruebas Serológicas (Se busca la confirmación detallada de género y especie del microorganismo con pruebas de de antígeno-anticuerpo o serológicas que básicamente permiten la confirmación de la identidad del germen sin dejar lugar a dudas).
En el caso específico de Listeria monocytogenes y dado que la prueba es extremadamente larga y con múltiples pasos detallados, se presenta un resumen de los pasos a seguir (anexamos dos vínculos de hipertexto detallados para su posterior consulta; el manual BAM de Estados Unidos y la Norma Oficial Mexicana 143 :
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/143ssa15.html
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm071400.htm
La técnica se usa con 25 ó 375 gramos de muestra de alimento ó 1mL de buffer residual de monitoreo con hisopo de dacrón o rayón usando un hisopo con Buffer neutralizante como el SRK de Copan, el caldo Letheen o similares) ó 10mL de buffer residual para monitoreo con esponja de celulosa estéril -el modelo más usado en el mundo son las bolsas Whirlpack de Nasco; vea la página de Nasco -www.enasco.com- para más detalles en cualquier parte del mundo o solicite informes en www.serco.com.mx si ud. desea adquirir alguna en México.
El primer paso es pre-enriquecer siguiendo la proporción 1:9 (25 en 225mL ó 1 en 9mL ó 375 en 3375 mL de medio de cultivo) durante un mínimo de 24-48 horas. Puede usarse caldo fraser modificado con cloruro de litio ó caldo UVM ó caldo Demi Fraser o Caldo de Enriquecimiento para Listeria con suplementos como PALCAM u otros) ó Caldo Soya Tripticaseína con 0.5% de extracto de levadura. Listeria monocytogenes es un microorganismo que crece en un rango muy amplio de temperaturas; universalmente se desarrolla mejor a una temperatura inferior al rango de enterobacterias: 30°C en vez de 35 a 37°C.
Posteriormente, el enriquecimiento selectivo se hace con Caldo de Enriquecimiento Bufferado para Listeria adicionado con Sales y Ácido MOPS ó según la técnica puede usarse el mismo Caldo Demi Fraser ó algún medio UVM modificado (por 24 a 48 hrs. adicionales a 30°C).
Al terminar el pre-enriquecimiento o la combinación del mismo con el enriquecimiento selectivo, suelen correrse los análisis rápidos de Screening que reconoce BAM. Para cualquier persona física o moral interesada en México en saber más al respecto, anexo un vínculo de una presentación comercial intitulada Listeria 2009.xls donde se describen métodos comercializados por Serco Comercial que tienen aprobación AOAC-OMA.
http://mail.serco.com.mx/apps/ierm/faqs.nsf/90c9ef7d3fabe69886256fff00019e34/bb83ca2ea41b4a768625725f007f1361/$FILE/LISTERIA%202009.xls
Se continúa con el enriquecimiento diferencial en placas. Los agares preferidos incluyen:
1) Agar MOX
2) Agar Oxford
3) Agar PALCAM
4) Agar LPM
5) Cromagar Listeria
6) ALOA (Agar Cromogénico Selectivo para Listeria)
Cada uno de ellos tiene un crecimiento específico para Listeria monocytogenes y para los demás microorganismos del género Listeria. En el caso de L.m. suelen ser negras con un halo negro o negruzco alrededor de las mismas en medios que contienen sales de esculina. Este paso conlleva 24 a 48 horas adicionales a 30°C.
Una vez que se tomaron las colonias representativas, la batería de pruebas bioquímicas presuntivas incluyen:
1) Prueba de movilidad (10min)
2) Prueba de Catalasa (10min)
3) Tinción de Gram (16-24 hrs)
Y las confirmatorias:
1) Beta hemólisis a 35°C por 48 hrs.
2) Movilidad en medio SIM por 7 días a temp. ambiente (25°C)
3) Reducción de nitratos a 35°C por 5 días
4) Prueba de CAMP a 35°C por 24-48 hrs.
Las pruebas finales para confirmación incluyen serología en Caldo Triptosa por 24- 48 horas adicionales (incubación a 30°C) para determinar si corresponde a los serotipos 1, 4 u otros.
Aunque se ha descrito de manera muy general el análisis y monitoreo de Listeria monocytogenes, al nivel de uso en plantas procesadoras de alimentos que conlleven un riesgo en el producto, desde el punto de vista técnico y económico, usar una prueba rápida para hacer un "screening" o detección previa de la existencia del germen, se ha convertido en la práctica más comúnde las empresas a nivel mundial. Esta bacteria es tan peligrosa, que debe acentuarse su detección a nivel de pre-operacional y operacional, especialmente en superficies de contacto, directo o indirecto más lugares húmedos y medio ambiente (sistema de aire y ventilación).
miércoles, 16 de septiembre de 2009
Tecnología de PCR para detección de patógenos
Después de una pequeña pausa, empezaremos a comentar con una frecuencia al menos semanal, de los tópicos que nos llevaron a crear este blog.
El tema de hoy es La Tecnología de PCR para detección de patógenos.
Desde los primeros tiempos en que empezaba la microbiología como la conocemos hoy, hacia finales del siglo XIX, con las investigaciones del Dr. Pasteur, el Dr. Koch, Samuel Petri, el Dr. Salmon y muchos renombrados individuos que pueden ser considerados como los iniciadores y que dejaron su huella para la posteridad, el ser humano se ha visto en la creciente necesidad de buscar encontrar, detectar y monitorear los seres biológicos invisibles que hoy en día conocemos a nivel genérico como microorganismos o microbios.
Este fascinante mundo, que en términos reales fueron los que primeros seres vivos que existieron sobre la Tierra (por ser la mayoría de ellos seres vivos unicelulares ó conformados por una sola célular) sigue siendo tema de estudio permanente desde esos tiempos y afortunadamente para la raza humana, se han seguido mejorando notablemente las diferentes metodologías de análisis para poder dictaminar su existencia hasta género y especie.
Hablando en términos específicos para monitoreo de microorganismos patógenos, como los que hemos hablado en temas anteriores, específicamente para tres de los microorganismos que más enfermedades causan en el ser humano y que son transmitidos mayoritariamente por consumo o ingesta de alimentos contaminados, a saber: Salmonella, Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7 (EHEC) existen tres grandes grupos de pruebas para detectarlos:
1) Microbiología tradicional en agares, caldos y serología.
2) Detección inmunológica rápida por anticuerpos en varios formatos:
Formatos de ELISA
Formatos de Inmunoprecipitación en Látex
Formatos de Inmunodifusión
Formatos de Inmunocaptura Magnética
3) Detección mediante Análisis del Material Genético de los microbios usando la tecnología de PCR (Polimerase Chain Reaction) ó de Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés.
En esta entrega del blog, comentaremos con cierto detalle qué es el PCR.
En términos muy entendibles, recordemos que todos los seres vivos y los virus (que no se consideran a nivel biológico como seres "vivos" en toda la extensión de la palabra, pero que son entes biológicos o seres que tienen características especiales) están constituidos de varios sistemas que mantienen las células que los conforman. En todos los casos, la estructura biológica por excelencia encargada de darle la "forma" a cada ser vivo, es el Acido Desoxirribonucleico o ADN (DNA en inglés). Este componente, se encuentra en los cromosomas de cada ser vivo y en el núcleo de cada microorganismo.
El ADN, es 100% único para cada ser vivo. Al ser formado por una cadena de 4 moléculas llamadas nucleótidos con sus respectivos pares complementarios y que forma una cadena o doble hélice con tramos tan cortos como 100 pares hasta varios millones, como en algunos genes humanos, existen trillones de combinaciones en esa cadena. Por la misma razón, pueden existir trillones de individuos con características totalmente distintas entre sí.
La tecnología de PCR ha tomado ventaja de esa peculiaridad del ADN y por medio del aislamiento de una parte o sección de la cadena de doble hélice, mediante un dispositivo biológico llamado Sonda y con la ayuda de una enzima especial conocida como TAQ POLIMERASA, cuya función es crear un número indeterminado de copias de fragmentos del ADN creando polímeros o copias idénticas de los los mismos, ha revolucionado por completo el mundo diagnóstico creando de facto, la disciplina que hoy llamamos Biología Molecular.
Los elementos que requiere esta tecnología son:
1) Primers
2) Sonda
3) Target u Objetivo
4) Taq Polimerasa
5) Termociclador de punto final ó de Tiempo Real
6) Sistema para detectar las copias al final (Electroforesis en gel, curvas de fusión por fluorescencia, curvas de producción de copias marcadas con fluorescencia (PCR Tiempo Real)
7) Control interno
Cada uno de los elementos cumple con una función específica:
1) Los primers es la secuencia específica de nucleótidos del ADN que son específicos del organismo que estamos tratando de detectar.
2) La sonda, que en el caso de los sistemas de Tiempo real suele ir marcada en los extremos, con un elemento conocido como Quencher (o amortiguador) y con otro que es un agente Fluorogénico o Fluoróforo. Se puede describir como una sección complementaria para los primers del microorganismo que estamos buscando detectar.
3) El target u objetivo es la secuencia simple complementaria a la que la sonda se unirá para generar su duplicación "n" veces en el ciclo que llamamos amplificación.
4) La Taq Polimerasa, es una enzima aislada del microorganismo Thermus aquaticus, encontrado en las fuentes termales de Yellowstone, Estados Unidos. Esta enzima es la responsable de generar copias o formar "polímeros" del target u objetivo, si tiene las condiciones necesarias de temperatura, acidez y oligoelementos como el cloruro de magnesio en una solución acuosa.
5) El termociclador es un dispositivo diseñado para generar de manera alterna condiciones de temperatura en rangos de 55 hasta 95°C, que permiten que la Taq Polimerasa pueda cumplir con su función de generado de copias o "amplificar" el ADN. Existen dos tipos básicos: Los de gradiente de temperatura en bloque sólido (aquí entran los de compañías como Applied Bioresearch, los de Qualicon, BioRad y otros más) y los rotativos (como el RotorGiene de Corbett Research, ahora de QIAGEN y los LightCyclers de Roche). Normalmente corren 40-50 ciclos en períodos desde 60 segundos hasta poco menos de 5 minutos; por lo cual el proceso de termociclado demora desde 45 mins hasta 3-4 horas.
6) El sistema más usado para detectar las copias generadas hasta hace poco menos de 20 años eran los sistemas de electroforesis en gel; en los últimos 10 años, surgió con más fuerza el uso de fluoróforos como el SYBR-GREEN, para poder medir la curva de fusión de los ciclos de amplificación y en los últimos 5 años, ha tomado más fuerza el uso de equipos termocicladores Tiempo Real, que usan fluoróforos altamente específicos y selectivos, que permiten incluso cuantificar concentraciones en función de las curvas de generación de la fluorescencia (en todos los casos anteriores, el termociclador tiene acoplado el sistema para detectar el SYBR-Green u otros fluoróforos; sólo para la electroforesis en gel se hace en equipos por separado).
7) El uso de controles internos se ha extendido cada vez más para demostrar, comprobar, verificar y validar al mismo tiempo que realmente ocurrió la reacción de amplificación. Estos suelen añadirse en los tubos de reacción o en los capilares que se introducen en el termociclador.
Para terminar esta descripción general sobre la Tecnología de PCR, cabe señalar que son cada vez más las empresas de todo tipo a nivel mundial y especialmente aquellas que elaboran productos sensibles a nivel microbiológico como las de alimentos congelados para consumo inmediato (RTE por las siglas en inglés), de alimentos para niños y/o fórmulas nutricionales, empresas de cárnicos procesados, empresas de productos lácteos frescos y procesadoras de alimentos orgánicos, las que han adoptado el uso comercial de esta tecnología.
Si usted está realmente interesado en alguna, busque que incluya preferentemente algun sistema de concentración de la muestra mediante un proceso como la Inmunoseparación Magnética (IMS en inglés), que es la tendencia de esta tecnología. Usar IMS acoplada con PCR Tiempo Real para buscar resultados en mucho menor tiempo de lo que tarda el método tradicional o pruebas inmunológicas como las que mencionamos anteriormente.
Actualización al Mes de Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs
El tema de hoy es La Tecnología de PCR para detección de patógenos.
Desde los primeros tiempos en que empezaba la microbiología como la conocemos hoy, hacia finales del siglo XIX, con las investigaciones del Dr. Pasteur, el Dr. Koch, Samuel Petri, el Dr. Salmon y muchos renombrados individuos que pueden ser considerados como los iniciadores y que dejaron su huella para la posteridad, el ser humano se ha visto en la creciente necesidad de buscar encontrar, detectar y monitorear los seres biológicos invisibles que hoy en día conocemos a nivel genérico como microorganismos o microbios.
Este fascinante mundo, que en términos reales fueron los que primeros seres vivos que existieron sobre la Tierra (por ser la mayoría de ellos seres vivos unicelulares ó conformados por una sola célular) sigue siendo tema de estudio permanente desde esos tiempos y afortunadamente para la raza humana, se han seguido mejorando notablemente las diferentes metodologías de análisis para poder dictaminar su existencia hasta género y especie.
Hablando en términos específicos para monitoreo de microorganismos patógenos, como los que hemos hablado en temas anteriores, específicamente para tres de los microorganismos que más enfermedades causan en el ser humano y que son transmitidos mayoritariamente por consumo o ingesta de alimentos contaminados, a saber: Salmonella, Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7 (EHEC) existen tres grandes grupos de pruebas para detectarlos:
1) Microbiología tradicional en agares, caldos y serología.
2) Detección inmunológica rápida por anticuerpos en varios formatos:
Formatos de ELISA
Formatos de Inmunoprecipitación en Látex
Formatos de Inmunodifusión
Formatos de Inmunocaptura Magnética
3) Detección mediante Análisis del Material Genético de los microbios usando la tecnología de PCR (Polimerase Chain Reaction) ó de Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés.
En esta entrega del blog, comentaremos con cierto detalle qué es el PCR.
En términos muy entendibles, recordemos que todos los seres vivos y los virus (que no se consideran a nivel biológico como seres "vivos" en toda la extensión de la palabra, pero que son entes biológicos o seres que tienen características especiales) están constituidos de varios sistemas que mantienen las células que los conforman. En todos los casos, la estructura biológica por excelencia encargada de darle la "forma" a cada ser vivo, es el Acido Desoxirribonucleico o ADN (DNA en inglés). Este componente, se encuentra en los cromosomas de cada ser vivo y en el núcleo de cada microorganismo.
El ADN, es 100% único para cada ser vivo. Al ser formado por una cadena de 4 moléculas llamadas nucleótidos con sus respectivos pares complementarios y que forma una cadena o doble hélice con tramos tan cortos como 100 pares hasta varios millones, como en algunos genes humanos, existen trillones de combinaciones en esa cadena. Por la misma razón, pueden existir trillones de individuos con características totalmente distintas entre sí.
La tecnología de PCR ha tomado ventaja de esa peculiaridad del ADN y por medio del aislamiento de una parte o sección de la cadena de doble hélice, mediante un dispositivo biológico llamado Sonda y con la ayuda de una enzima especial conocida como TAQ POLIMERASA, cuya función es crear un número indeterminado de copias de fragmentos del ADN creando polímeros o copias idénticas de los los mismos, ha revolucionado por completo el mundo diagnóstico creando de facto, la disciplina que hoy llamamos Biología Molecular.
Los elementos que requiere esta tecnología son:
1) Primers
2) Sonda
3) Target u Objetivo
4) Taq Polimerasa
5) Termociclador de punto final ó de Tiempo Real
6) Sistema para detectar las copias al final (Electroforesis en gel, curvas de fusión por fluorescencia, curvas de producción de copias marcadas con fluorescencia (PCR Tiempo Real)
7) Control interno
Cada uno de los elementos cumple con una función específica:
1) Los primers es la secuencia específica de nucleótidos del ADN que son específicos del organismo que estamos tratando de detectar.
2) La sonda, que en el caso de los sistemas de Tiempo real suele ir marcada en los extremos, con un elemento conocido como Quencher (o amortiguador) y con otro que es un agente Fluorogénico o Fluoróforo. Se puede describir como una sección complementaria para los primers del microorganismo que estamos buscando detectar.
3) El target u objetivo es la secuencia simple complementaria a la que la sonda se unirá para generar su duplicación "n" veces en el ciclo que llamamos amplificación.
4) La Taq Polimerasa, es una enzima aislada del microorganismo Thermus aquaticus, encontrado en las fuentes termales de Yellowstone, Estados Unidos. Esta enzima es la responsable de generar copias o formar "polímeros" del target u objetivo, si tiene las condiciones necesarias de temperatura, acidez y oligoelementos como el cloruro de magnesio en una solución acuosa.
5) El termociclador es un dispositivo diseñado para generar de manera alterna condiciones de temperatura en rangos de 55 hasta 95°C, que permiten que la Taq Polimerasa pueda cumplir con su función de generado de copias o "amplificar" el ADN. Existen dos tipos básicos: Los de gradiente de temperatura en bloque sólido (aquí entran los de compañías como Applied Bioresearch, los de Qualicon, BioRad y otros más) y los rotativos (como el RotorGiene de Corbett Research, ahora de QIAGEN y los LightCyclers de Roche). Normalmente corren 40-50 ciclos en períodos desde 60 segundos hasta poco menos de 5 minutos; por lo cual el proceso de termociclado demora desde 45 mins hasta 3-4 horas.
6) El sistema más usado para detectar las copias generadas hasta hace poco menos de 20 años eran los sistemas de electroforesis en gel; en los últimos 10 años, surgió con más fuerza el uso de fluoróforos como el SYBR-GREEN, para poder medir la curva de fusión de los ciclos de amplificación y en los últimos 5 años, ha tomado más fuerza el uso de equipos termocicladores Tiempo Real, que usan fluoróforos altamente específicos y selectivos, que permiten incluso cuantificar concentraciones en función de las curvas de generación de la fluorescencia (en todos los casos anteriores, el termociclador tiene acoplado el sistema para detectar el SYBR-Green u otros fluoróforos; sólo para la electroforesis en gel se hace en equipos por separado).
7) El uso de controles internos se ha extendido cada vez más para demostrar, comprobar, verificar y validar al mismo tiempo que realmente ocurrió la reacción de amplificación. Estos suelen añadirse en los tubos de reacción o en los capilares que se introducen en el termociclador.
Para terminar esta descripción general sobre la Tecnología de PCR, cabe señalar que son cada vez más las empresas de todo tipo a nivel mundial y especialmente aquellas que elaboran productos sensibles a nivel microbiológico como las de alimentos congelados para consumo inmediato (RTE por las siglas en inglés), de alimentos para niños y/o fórmulas nutricionales, empresas de cárnicos procesados, empresas de productos lácteos frescos y procesadoras de alimentos orgánicos, las que han adoptado el uso comercial de esta tecnología.
Si usted está realmente interesado en alguna, busque que incluya preferentemente algun sistema de concentración de la muestra mediante un proceso como la Inmunoseparación Magnética (IMS en inglés), que es la tendencia de esta tecnología. Usar IMS acoplada con PCR Tiempo Real para buscar resultados en mucho menor tiempo de lo que tarda el método tradicional o pruebas inmunológicas como las que mencionamos anteriormente.
Actualización al Mes de Mayo de 2013:
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs
lunes, 8 de junio de 2009
Nueva página web del gobierno de los Estados Unidos
El gobierno de los Estados Unidos, ahora con la nueva administración del Presidente Barack Obama, no solamente está preocupado por la inocuidad de los alimentos. Acaba de crear un sistema de seguimiento administrativo multidisciplinario para coordinar esfuerzos de la FDA, USDA y CDC junto con otras instituciones para capitalizar, divulgar, capacitar y difundir entre toda la comunidad estadounidense y el resto del mundo, de los esfuerzos que harán en materia de inocuidad y seguridad de todo el suministro de alimentos en su país.
Con la mente de los consumidores al tanto de casos como el Peanuts Corporation of America y todas las derivaciones que tuvo en la cadena de alimentos estadounidense por la contaminación con Salmonella, es un hecho que la Inocuidad para la nueva administración es no solamente un compromiso y un desafío, sino una prioridad de las más importantes en la lista.
Ver la siguiente dirección electrónica:
http://www.foodsafetyworkinggroup.gov/Home.htm
Con la mente de los consumidores al tanto de casos como el Peanuts Corporation of America y todas las derivaciones que tuvo en la cadena de alimentos estadounidense por la contaminación con Salmonella, es un hecho que la Inocuidad para la nueva administración es no solamente un compromiso y un desafío, sino una prioridad de las más importantes en la lista.
Ver la siguiente dirección electrónica:
http://www.foodsafetyworkinggroup.gov/Home.htm
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