Conforme avanzan las tecnologías para la detección de microorganismos, se ha hecho patente que las compañías de alimentos siguen en búsqueda del método más rápido, pero que no sacrifique la precisión ni la confiabilidad de los resultados para tomar criterios de liberar o detener lotes de alimentos presumiblemente contaminados con microorganismos patógenos.
La tecnología más sensible que hasta ahora se conoce, es la basada en la determinación del material genético o Acido Desoxirribonucleico (ADN o DNA por las siglas en inglés) mediante un proceso conocido como PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
En términos muy simples, esta tecnología llega hasta el ADN que se encuentra en el núcleo de las células de los seres vivos, en este caso microorganismos patógenos como Salmonella, Listeria monocytogenes y E.coliO157:H7 y por medio de un proceso especial, se localizan fragmentos específicos de dicho material genético, a manera de huellas digitales, únicos e irrepetibles, para reproducirlos artificialmente en un ciclo llamado de termociclado “n” veces y entonces, todas esas copias son interpretadas por algún sistema especial como la electroforesis en gel u otros. En caso de que esas copias den un resultado predefinido, se identifica positivamente la identidad del microorganismo y permite tomar decisiones en un tiempo mucho más rápido que el largo y costoso método tradicional.
Existen pocas compañías que manejan la tecnología de PCR con una aplicación comercial para alimentos. Biocontrol Systems, desarrolló el sistema conocido como Assurance GDS, que incorpora los avances más sofisticados para la detección de microorganismos patógenos.
Considerando la complejidad del tema y que el espacio es limitado, en esta ocasión solamente señalaremos las características primordiales que pueden ser de interés para el procesador de alimentos mexicano:
1) Genera resultados finales en menos de 8 horas totales para E.coliO157:H7 y/o sus Shigatoxinas incluyendo el pre-enriquecimiento.
2) Genera resultados finales en menos de 22 horas totales para Salmonella, Listeria sp. y Listeria monocytogenes, incluyendo el pre-enriquecimiento.
3) Es la única tecnología de PCR en el mercado que en vez de DILUIR las muestras al prepararlas para evitar que generen interferencias, las concentra más de 10 veces.
4) Incluye un novedoso sistema de IMS (Separación Inmunomagnética) para lograr reducir al máximo los tiempos de pre-enriquecimiento sin perder sensibilidad.
5) Más del 80% de las compañías de cárnicos más grandes de los Estados Unidos han dejado la tecnología de PCR de otros proveedores, para migrar hacia Assurance GDS.
6) Produce resultados en tiempo real por su novedoso termociclador modelo RotorGiene que eficientiza enormemente los tiempos de multiplicación del ADN de los microorganismos objetivo.
7) Es prácticamente el único sistema de PCR en el mercado que no tiene que interpretar curvas de fusión ni produce resultados “indeterminados” que tienen que repetirse.
8) La correlación de los estudios colaborativos contra el Manual de Bacteriología Analítica (BAM) de los EEUU rebasa ampliamente los requisitos mínimos para los métodos oficiales de análisis.
Si en su empresa están considerando mejorar su sistema de PCR ó están interesados en la mejor tecnología en su género, pongase en contacto con el suscrito para recibir información adicional y verificar si su empresa es candidata para esta tecnología analítica.
Puede encontrar más información en:
http://www.biocontrolsys.com/products/gdsintro.html
http://www.blog.serco.com.mx/index.php/16-assurance-gds-para-salmonella-en-8hs
domingo, 5 de septiembre de 2010
La Norma 251 en México y sus implicaciones
Una de las percepciones que se ha generado en los países latinoamericanos, incluyendo México, es que sus legislaciones en seguridad e inocuidad de los alimentos tienen grandes diferencias con los países con legislaciones más avanzadas como los europeos y los estadunidenses (USA).
Esas diferencias, además de la necesidad de estandarizar a nivel internacional un sistema integral de inocuidad que sea homólogo entre todos los países y que tenga sus fundamentos en un sistema HACCP ó ISO22000, que están enfocados en crear una estructura de análisis de riesgos y puntos críticos de control, basados en la prevención y en el control de procesos con las Buenas Prácticas de Manufactura y con los Procedimientos de Operación Estándar de Saneamiento.
En nuestro país, las Normas Oficiales Mexicanas que controlan la producción e inocuidad de alimentos hasta Diciembre del 2009, eran la NOM-120 y la NOM-093, que se enfocaban a los controles sanitarios y buenas prácticas de manufactura y saneamiento para establecimientos procesadores de alimentos hasta establecimientos fijos y semifijos donde se expenden los mismos como restaurantes, negocios de comidas, comisariatos y similares.
Ante la continua presencia de enfermedades transmitidas por alimentos, el problema de la influenza AH1N1 del 2009, el surgimiento de más patógenos emergentes como todas las E.coli enterohemorrágicas además de la E.coli157:H7 y la notoria e imparable globalización en el suministro mundial de alimentos y considerando que nuestro país es uno de los jugadores de peso en la industria global de exportación de alimentos frescos, sobre todo de origen vegetal, el Sistema Federal de Salud, por medio de su brazo de control la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (Cofepris) inició, consultó y decretó finalmente en Diciembre de 2009, NOM-251-SSA1-2009 Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios, que entra en vigor oficial desde Septiembre de 2010, 270 días después de su publicación.
La importancia de esta norma oficial mexicana es que está oficializando la necesidad de que cualquier procesador de alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, tenga implementado un sistema de calidad e inocuidad de sus productos, desde el campo hasta la mesa, porque exige la trazabilidad de las materias primas hasta el producto terminado y continúa hasta los canales mismos de distribución, porque en ninguna norma previa, se documentaba que productos contaminados con adulterantes que puedan causar un daño a la salud (sean fìsicos, químicos o microbiológicos) deban ser retirados del mercado con un proceso documentado y controlado, incluyendo el aviso a la autoridad sanitaria de dichos eventos y actividades.
Analizando la literatura de la Administración de Drogas y Alimentos de Estados Unidos (FDA) y del Departamento Federal de Inspección Sanitaria (FSIS) como brazo de la Secretaría de Agricultura (USDA), podemos encontrar que en el país vecino existen más de 20,000 retiros de producto anuales por contaminantes detectados por los laboratorios de estas instituciones, cuando en México, como consumidor, no existe información que se acerque ni siquiera al 1% de esa cifra, con alcance nacional y que sea documentado como en los Estados Unidos, en los medios de difusión que incluyen radio, periódico, comunicación por internet y en las páginas mismas de los productores que tuvieron que realizar estos retiros para protección del consumidor.
¿Cuál es la trascendencia de esta normatividad para los procesadores en México? Simple y sencillamente que las empresas tendrán la obligación de implementar un plan de análisis de riesgos por obligación de la autoridad sanitaria y no solo por requerimientos de sus clientes. Para el consumidor mexicano es la mejor de las noticias.
Esas diferencias, además de la necesidad de estandarizar a nivel internacional un sistema integral de inocuidad que sea homólogo entre todos los países y que tenga sus fundamentos en un sistema HACCP ó ISO22000, que están enfocados en crear una estructura de análisis de riesgos y puntos críticos de control, basados en la prevención y en el control de procesos con las Buenas Prácticas de Manufactura y con los Procedimientos de Operación Estándar de Saneamiento.
En nuestro país, las Normas Oficiales Mexicanas que controlan la producción e inocuidad de alimentos hasta Diciembre del 2009, eran la NOM-120 y la NOM-093, que se enfocaban a los controles sanitarios y buenas prácticas de manufactura y saneamiento para establecimientos procesadores de alimentos hasta establecimientos fijos y semifijos donde se expenden los mismos como restaurantes, negocios de comidas, comisariatos y similares.
Ante la continua presencia de enfermedades transmitidas por alimentos, el problema de la influenza AH1N1 del 2009, el surgimiento de más patógenos emergentes como todas las E.coli enterohemorrágicas además de la E.coli157:H7 y la notoria e imparable globalización en el suministro mundial de alimentos y considerando que nuestro país es uno de los jugadores de peso en la industria global de exportación de alimentos frescos, sobre todo de origen vegetal, el Sistema Federal de Salud, por medio de su brazo de control la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (Cofepris) inició, consultó y decretó finalmente en Diciembre de 2009, NOM-251-SSA1-2009 Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios, que entra en vigor oficial desde Septiembre de 2010, 270 días después de su publicación.
La importancia de esta norma oficial mexicana es que está oficializando la necesidad de que cualquier procesador de alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, tenga implementado un sistema de calidad e inocuidad de sus productos, desde el campo hasta la mesa, porque exige la trazabilidad de las materias primas hasta el producto terminado y continúa hasta los canales mismos de distribución, porque en ninguna norma previa, se documentaba que productos contaminados con adulterantes que puedan causar un daño a la salud (sean fìsicos, químicos o microbiológicos) deban ser retirados del mercado con un proceso documentado y controlado, incluyendo el aviso a la autoridad sanitaria de dichos eventos y actividades.
Analizando la literatura de la Administración de Drogas y Alimentos de Estados Unidos (FDA) y del Departamento Federal de Inspección Sanitaria (FSIS) como brazo de la Secretaría de Agricultura (USDA), podemos encontrar que en el país vecino existen más de 20,000 retiros de producto anuales por contaminantes detectados por los laboratorios de estas instituciones, cuando en México, como consumidor, no existe información que se acerque ni siquiera al 1% de esa cifra, con alcance nacional y que sea documentado como en los Estados Unidos, en los medios de difusión que incluyen radio, periódico, comunicación por internet y en las páginas mismas de los productores que tuvieron que realizar estos retiros para protección del consumidor.
¿Cuál es la trascendencia de esta normatividad para los procesadores en México? Simple y sencillamente que las empresas tendrán la obligación de implementar un plan de análisis de riesgos por obligación de la autoridad sanitaria y no solo por requerimientos de sus clientes. Para el consumidor mexicano es la mejor de las noticias.
jueves, 3 de diciembre de 2009
Video en español de Buenas Prácticas de Manufactura
Buscando en la web, encontramos una excelente fuente de información para redondear y enriquecer lo que hemos comentado en entradas previas de este blog.
Se anexa esta entrada referente a las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) para la producción de alimentos inocuos y/o libres de contaminantes biológicos, físicos o químicos de acuerdo al programa HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points) ó Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control por sus siglas en inglés.
Posteriormente se añadirán videos complementarios; este video es el primero de una serie.
Se anexa esta entrada referente a las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) para la producción de alimentos inocuos y/o libres de contaminantes biológicos, físicos o químicos de acuerdo al programa HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points) ó Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control por sus siglas en inglés.
Posteriormente se añadirán videos complementarios; este video es el primero de una serie.
miércoles, 2 de diciembre de 2009
Video de Inocuo.TV respecto a Listeria monocytogenes
El siguiente vínculo presenta información sumamente interesante referente a Listeria monocytogenes y la inocuidad en productos hortofrutícolas. Está tomado directamente del portal de www.inocuo.tv
http://www.inocuo.tv/index.php?option=com_hwdvideoshare&task=viewvideo&Itemid=64&video_id=27
miércoles, 18 de noviembre de 2009
La Importancia de la higiene del personal en la Industria de Alimentos
¿Sabía ud. que más del 60% de las enfermedades transmitidas por alimentos tienen su origen en la vía de transmisión fecal-oral a través de las manos del personal, acorde con datos oficiales de la Secretaría de Salud en México, datos de la Organización Mundial de Salud e instituciones como la Administración para Drogas y Alimentos de Estados Unidos (FDA)?
Actualmente, muchas empresas mexicanas, con especial énfasis todas las que exportan sus productos, han implementado programas de monitoreo sanitario de su personal que manipula alimentos durante todo el proceso y aún a pesar de ello, siguen existiendo productos contaminados por manipulación inadecuada.
¿Hay alguna solución? Entrenamiento y monitoreo continuo sobre las técnicas del lavado efectivo de manos, sobre una base periódica y programada, además de auditar y recertificar la manera en que la gente está siguiendo las buenas prácticas para el lavado y la desinfección de las manos.
Cabe señalar que todas las bacterias y virus enteropatógenos de importancia sanitaria incluyendo Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, virus de la hepatitis A, B y C; Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringens y C.botulinum y Campylobacter jejuni o Campylobacter coli están incluidos dentro de esa ruta de transmisión fecal-oral (manos mal lavadas a equipo o superficies que a su vez contaminarán el producto terminado o a medio proceso).
Existen productos especialmente diseñados para permitirle al personal de aseguramiento de calidad el saber el grado de entrenamiento y la efectividad de la técnica seguida por los operadores en tiempo real. Existen simuladores bacterianos en el mercado que "simulan" la presencia de bacterias con polímeros plásticos que son visibles bajo luz ultravioleta de 365nm y son sumamente efectivos para poder entrenar al personal en la demostración física de la importancia de la higiene.
Hay otras alternativas como el uso de un kit que desarrollamos de manera interna en la empresa para la cual prestamos nuestros servicios que intitulamos como "Hands Check" y por un costo extremadamente reducido (menos de 1.50 USD por operador) se puede hacer un monitoreo de presencia-ausencia de coliformes totales y Escherichia coli en las manos de un operador con resultados tan rápidos como 4 horas y hasta un máximo de 18 horas. Si usted está leyendo el presente documento, por favor mande un correo a luis70@yahoo.com para que le pueda enviar información adicional directamente a su correo.
Continuaremos con más este tema posteriormente.
¿Sabía ud. que más del 60% de las enfermedades transmitidas por alimentos tienen su origen en la vía de transmisión fecal-oral a través de las manos del personal, acorde con datos oficiales de la Secretaría de Salud en México, datos de la Organización Mundial de Salud e instituciones como la Administración para Drogas y Alimentos de Estados Unidos (FDA)?
Actualmente, muchas empresas mexicanas, con especial énfasis todas las que exportan sus productos, han implementado programas de monitoreo sanitario de su personal que manipula alimentos durante todo el proceso y aún a pesar de ello, siguen existiendo productos contaminados por manipulación inadecuada.
¿Hay alguna solución? Entrenamiento y monitoreo continuo sobre las técnicas del lavado efectivo de manos, sobre una base periódica y programada, además de auditar y recertificar la manera en que la gente está siguiendo las buenas prácticas para el lavado y la desinfección de las manos.
Cabe señalar que todas las bacterias y virus enteropatógenos de importancia sanitaria incluyendo Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coliO157:H7, virus de la hepatitis A, B y C; Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringens y C.botulinum y Campylobacter jejuni o Campylobacter coli están incluidos dentro de esa ruta de transmisión fecal-oral (manos mal lavadas a equipo o superficies que a su vez contaminarán el producto terminado o a medio proceso).
Existen productos especialmente diseñados para permitirle al personal de aseguramiento de calidad el saber el grado de entrenamiento y la efectividad de la técnica seguida por los operadores en tiempo real. Existen simuladores bacterianos en el mercado que "simulan" la presencia de bacterias con polímeros plásticos que son visibles bajo luz ultravioleta de 365nm y son sumamente efectivos para poder entrenar al personal en la demostración física de la importancia de la higiene.
Hay otras alternativas como el uso de un kit que desarrollamos de manera interna en la empresa para la cual prestamos nuestros servicios que intitulamos como "Hands Check" y por un costo extremadamente reducido (menos de 1.50 USD por operador) se puede hacer un monitoreo de presencia-ausencia de coliformes totales y Escherichia coli en las manos de un operador con resultados tan rápidos como 4 horas y hasta un máximo de 18 horas. Si usted está leyendo el presente documento, por favor mande un correo a luis70@yahoo.com para que le pueda enviar información adicional directamente a su correo.
Continuaremos con más este tema posteriormente.
martes, 17 de noviembre de 2009
Aspectos prioritarios para buscar en un Sistema de Bioluminiscencia de ATP
La tecnología de Bioluminiscencia de ATP, permite la liberación de todo tipo de equipos y superficies de contacto, incluyendo guantes, mandiles e indumentaria del personal de empaque, en tan sólo 12 segundos, mediante la reacción de bioluminiscencia de ATP. Es 10,000,000 de veces más sensible que el ojo humano y por ello su alta confiabilidad. También cuenta con la opción de liberación de líquidos procedentes de lavados por recirculación como CIP en los mismos 12 segundos.
Es muy importante que busque un sistema de bioluminiscencia de ATP que le garantice que todos los datos registrados no sean editables y sean 100% auditables mediante el sistema de análisis de datos del mismo, preferentemente basado en algún formato como Excel de Windows. Mientras más puntos de muestreo logre configurar (hay equipos con 50, 200 y hasta 1000 puntos configurables) y almacenar; en esa medida podrá tener un historial estadístico más completo.
Algunas consideraciones adicionales:
*Busque portabilidad en su sistema de bioluminiscencia de ATP.
*Busque que tenga batería de Litio-MH como las que se usan en la tecnología celular para que garantice rendimiento óptimo el 100% del tiempo.
*Hay algunos equipos o sistemas de Bioluminiscencia de ATP que usan Fotodiodos y otros que usan PMT. Los estudios más serios indican que los que usan PMT realmente son más sensibles y precisos que aquellos que usan fotodiodos (aunque los fabricantes de los equipos con fotodiodos dicen exactamente lo contrario).
*Busque algún equipo que no tenga interferencia por sanitizantes o productos químicos para higiene y desinfección; recuerde que la reacción de bioluminiscencia de ATP es afectada por ellos.
*Recuerde que cualquier medición de ATP con un sistema de Bioluminiscencia es biocarga total; si quiere usarlo para múltiples funciones amparado en ATP, su imprecisión será elevada.
En otro post discutiremos más ampliamente el tema de Sistemas de Bioluminiscencia de ATP.
lunes, 16 de noviembre de 2009
Análisis de Listeria monocytogenes
El monitoreo y análisis de Listeria monocytogenes es uno de los más demandantes entre los microorganismos patógenos.
Las características del lento desarrollo de este microorganismo, lo hacen particularmente especial para ser detectado mediante la microbiología tradicional.
Los pasos a seguir son virtualmente idénticos al del resto de los microorganismos patógenos:
1) Pre-enriquecimiento (para pre-seleccionar y acondicionar al microorganismo para el siguiente c/paso)
2) Enriquecimiento selectivo (donde se busca generar de pasar de 1ufc/g hasta 1,000,000 ufc/g o hacerlo crecer 6 logaritmos; para que pueda ser detectado por el método tradicional posterior ó alguna de las técnicas rápidas existentes en el mercado como el PCR, la tecnología ELISA o sus variantes, la inmunoprecipitación visual en látex o con oro coloidal y similares).
3) Enriquecimiento diferencial (los pasos previos suelen ser regularmente en caldos por el mejor desarrollo en medio líquido que el agar; en este paso se busca aislar el microorganismo para generar colonias puras que luego puedan ser detectadas mediante pruebas bioquímicas presuntivas, confirmatorias o serológicas posteriormente).
4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas (Se corre una serie de pruebas para buscar diferenciar las colonias puras que se hayan seleccionado por características morfológicas como forma, color, brillo y/o similares acorde a la literatura reportada)
5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas (Con los resultados de las pruebas presuntivas, se tiene suficiente evidencia para seleccionar una batería de análisis bioquímicos altamente específicos que son exclusivos del microorganismo objetivo).
6) Pruebas Serológicas (Se busca la confirmación detallada de género y especie del microorganismo con pruebas de de antígeno-anticuerpo o serológicas que básicamente permiten la confirmación de la identidad del germen sin dejar lugar a dudas).
En el caso específico de Listeria monocytogenes y dado que la prueba es extremadamente larga y con múltiples pasos detallados, se presenta un resumen de los pasos a seguir (anexamos dos vínculos de hipertexto detallados para su posterior consulta; el manual BAM de Estados Unidos y la Norma Oficial Mexicana 143 :
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/143ssa15.html
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm071400.htm
La técnica se usa con 25 ó 375 gramos de muestra de alimento ó 1mL de buffer residual de monitoreo con hisopo de dacrón o rayón usando un hisopo con Buffer neutralizante como el SRK de Copan, el caldo Letheen o similares) ó 10mL de buffer residual para monitoreo con esponja de celulosa estéril -el modelo más usado en el mundo son las bolsas Whirlpack de Nasco; vea la página de Nasco -www.enasco.com- para más detalles en cualquier parte del mundo o solicite informes en www.serco.com.mx si ud. desea adquirir alguna en México.
El primer paso es pre-enriquecer siguiendo la proporción 1:9 (25 en 225mL ó 1 en 9mL ó 375 en 3375 mL de medio de cultivo) durante un mínimo de 24-48 horas. Puede usarse caldo fraser modificado con cloruro de litio ó caldo UVM ó caldo Demi Fraser o Caldo de Enriquecimiento para Listeria con suplementos como PALCAM u otros) ó Caldo Soya Tripticaseína con 0.5% de extracto de levadura. Listeria monocytogenes es un microorganismo que crece en un rango muy amplio de temperaturas; universalmente se desarrolla mejor a una temperatura inferior al rango de enterobacterias: 30°C en vez de 35 a 37°C.
Posteriormente, el enriquecimiento selectivo se hace con Caldo de Enriquecimiento Bufferado para Listeria adicionado con Sales y Ácido MOPS ó según la técnica puede usarse el mismo Caldo Demi Fraser ó algún medio UVM modificado (por 24 a 48 hrs. adicionales a 30°C).
Al terminar el pre-enriquecimiento o la combinación del mismo con el enriquecimiento selectivo, suelen correrse los análisis rápidos de Screening que reconoce BAM. Para cualquier persona física o moral interesada en México en saber más al respecto, anexo un vínculo de una presentación comercial intitulada Listeria 2009.xls donde se describen métodos comercializados por Serco Comercial que tienen aprobación AOAC-OMA.
http://mail.serco.com.mx/apps/ierm/faqs.nsf/90c9ef7d3fabe69886256fff00019e34/bb83ca2ea41b4a768625725f007f1361/$FILE/LISTERIA%202009.xls
Se continúa con el enriquecimiento diferencial en placas. Los agares preferidos incluyen:
1) Agar MOX
2) Agar Oxford
3) Agar PALCAM
4) Agar LPM
5) Cromagar Listeria
6) ALOA (Agar Cromogénico Selectivo para Listeria)
Cada uno de ellos tiene un crecimiento específico para Listeria monocytogenes y para los demás microorganismos del género Listeria. En el caso de L.m. suelen ser negras con un halo negro o negruzco alrededor de las mismas en medios que contienen sales de esculina. Este paso conlleva 24 a 48 horas adicionales a 30°C.
Una vez que se tomaron las colonias representativas, la batería de pruebas bioquímicas presuntivas incluyen:
1) Prueba de movilidad (10min)
2) Prueba de Catalasa (10min)
3) Tinción de Gram (16-24 hrs)
Y las confirmatorias:
1) Beta hemólisis a 35°C por 48 hrs.
2) Movilidad en medio SIM por 7 días a temp. ambiente (25°C)
3) Reducción de nitratos a 35°C por 5 días
4) Prueba de CAMP a 35°C por 24-48 hrs.
Las pruebas finales para confirmación incluyen serología en Caldo Triptosa por 24- 48 horas adicionales (incubación a 30°C) para determinar si corresponde a los serotipos 1, 4 u otros.
Aunque se ha descrito de manera muy general el análisis y monitoreo de Listeria monocytogenes, al nivel de uso en plantas procesadoras de alimentos que conlleven un riesgo en el producto, desde el punto de vista técnico y económico, usar una prueba rápida para hacer un "screening" o detección previa de la existencia del germen, se ha convertido en la práctica más comúnde las empresas a nivel mundial. Esta bacteria es tan peligrosa, que debe acentuarse su detección a nivel de pre-operacional y operacional, especialmente en superficies de contacto, directo o indirecto más lugares húmedos y medio ambiente (sistema de aire y ventilación).
Las características del lento desarrollo de este microorganismo, lo hacen particularmente especial para ser detectado mediante la microbiología tradicional.
Los pasos a seguir son virtualmente idénticos al del resto de los microorganismos patógenos:
1) Pre-enriquecimiento (para pre-seleccionar y acondicionar al microorganismo para el siguiente c/paso)
2) Enriquecimiento selectivo (donde se busca generar de pasar de 1ufc/g hasta 1,000,000 ufc/g o hacerlo crecer 6 logaritmos; para que pueda ser detectado por el método tradicional posterior ó alguna de las técnicas rápidas existentes en el mercado como el PCR, la tecnología ELISA o sus variantes, la inmunoprecipitación visual en látex o con oro coloidal y similares).
3) Enriquecimiento diferencial (los pasos previos suelen ser regularmente en caldos por el mejor desarrollo en medio líquido que el agar; en este paso se busca aislar el microorganismo para generar colonias puras que luego puedan ser detectadas mediante pruebas bioquímicas presuntivas, confirmatorias o serológicas posteriormente).
4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas (Se corre una serie de pruebas para buscar diferenciar las colonias puras que se hayan seleccionado por características morfológicas como forma, color, brillo y/o similares acorde a la literatura reportada)
5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas (Con los resultados de las pruebas presuntivas, se tiene suficiente evidencia para seleccionar una batería de análisis bioquímicos altamente específicos que son exclusivos del microorganismo objetivo).
6) Pruebas Serológicas (Se busca la confirmación detallada de género y especie del microorganismo con pruebas de de antígeno-anticuerpo o serológicas que básicamente permiten la confirmación de la identidad del germen sin dejar lugar a dudas).
En el caso específico de Listeria monocytogenes y dado que la prueba es extremadamente larga y con múltiples pasos detallados, se presenta un resumen de los pasos a seguir (anexamos dos vínculos de hipertexto detallados para su posterior consulta; el manual BAM de Estados Unidos y la Norma Oficial Mexicana 143 :
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/143ssa15.html
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm071400.htm
La técnica se usa con 25 ó 375 gramos de muestra de alimento ó 1mL de buffer residual de monitoreo con hisopo de dacrón o rayón usando un hisopo con Buffer neutralizante como el SRK de Copan, el caldo Letheen o similares) ó 10mL de buffer residual para monitoreo con esponja de celulosa estéril -el modelo más usado en el mundo son las bolsas Whirlpack de Nasco; vea la página de Nasco -www.enasco.com- para más detalles en cualquier parte del mundo o solicite informes en www.serco.com.mx si ud. desea adquirir alguna en México.
El primer paso es pre-enriquecer siguiendo la proporción 1:9 (25 en 225mL ó 1 en 9mL ó 375 en 3375 mL de medio de cultivo) durante un mínimo de 24-48 horas. Puede usarse caldo fraser modificado con cloruro de litio ó caldo UVM ó caldo Demi Fraser o Caldo de Enriquecimiento para Listeria con suplementos como PALCAM u otros) ó Caldo Soya Tripticaseína con 0.5% de extracto de levadura. Listeria monocytogenes es un microorganismo que crece en un rango muy amplio de temperaturas; universalmente se desarrolla mejor a una temperatura inferior al rango de enterobacterias: 30°C en vez de 35 a 37°C.
Posteriormente, el enriquecimiento selectivo se hace con Caldo de Enriquecimiento Bufferado para Listeria adicionado con Sales y Ácido MOPS ó según la técnica puede usarse el mismo Caldo Demi Fraser ó algún medio UVM modificado (por 24 a 48 hrs. adicionales a 30°C).
Al terminar el pre-enriquecimiento o la combinación del mismo con el enriquecimiento selectivo, suelen correrse los análisis rápidos de Screening que reconoce BAM. Para cualquier persona física o moral interesada en México en saber más al respecto, anexo un vínculo de una presentación comercial intitulada Listeria 2009.xls donde se describen métodos comercializados por Serco Comercial que tienen aprobación AOAC-OMA.
http://mail.serco.com.mx/apps/ierm/faqs.nsf/90c9ef7d3fabe69886256fff00019e34/bb83ca2ea41b4a768625725f007f1361/$FILE/LISTERIA%202009.xls
Se continúa con el enriquecimiento diferencial en placas. Los agares preferidos incluyen:
1) Agar MOX
2) Agar Oxford
3) Agar PALCAM
4) Agar LPM
5) Cromagar Listeria
6) ALOA (Agar Cromogénico Selectivo para Listeria)
Cada uno de ellos tiene un crecimiento específico para Listeria monocytogenes y para los demás microorganismos del género Listeria. En el caso de L.m. suelen ser negras con un halo negro o negruzco alrededor de las mismas en medios que contienen sales de esculina. Este paso conlleva 24 a 48 horas adicionales a 30°C.
Una vez que se tomaron las colonias representativas, la batería de pruebas bioquímicas presuntivas incluyen:
1) Prueba de movilidad (10min)
2) Prueba de Catalasa (10min)
3) Tinción de Gram (16-24 hrs)
Y las confirmatorias:
1) Beta hemólisis a 35°C por 48 hrs.
2) Movilidad en medio SIM por 7 días a temp. ambiente (25°C)
3) Reducción de nitratos a 35°C por 5 días
4) Prueba de CAMP a 35°C por 24-48 hrs.
Las pruebas finales para confirmación incluyen serología en Caldo Triptosa por 24- 48 horas adicionales (incubación a 30°C) para determinar si corresponde a los serotipos 1, 4 u otros.
Aunque se ha descrito de manera muy general el análisis y monitoreo de Listeria monocytogenes, al nivel de uso en plantas procesadoras de alimentos que conlleven un riesgo en el producto, desde el punto de vista técnico y económico, usar una prueba rápida para hacer un "screening" o detección previa de la existencia del germen, se ha convertido en la práctica más comúnde las empresas a nivel mundial. Esta bacteria es tan peligrosa, que debe acentuarse su detección a nivel de pre-operacional y operacional, especialmente en superficies de contacto, directo o indirecto más lugares húmedos y medio ambiente (sistema de aire y ventilación).
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